RUSYA FEDERASYONU SAĞLIK BAKANLIĞI

GENEL FARMAKOPEN İZNİ

Bakteriyel OFS.1.2.4.0006.15
endotoksinler GF XII yerine, bölüm 1 OFS 42-0062-07

Bu makale, tıbbi ürünlerde bakteriyel endotoksinlerin belirlenmesine yönelik yöntemleri açıklamaktadır. parenteral kullanım ve bunların üretiminde kullanılan farmasötik maddeler.

Bakteriyel endotoksin içeriğinin belirlenmesi, at nalı yengecinin kan hücrelerinin (amoebositler) bir lisatı olan bir reaktif kullanılarak gerçekleştirilir. limuzin polifemus(LAL reaktifi) veya tachypleus tridentatus (TAL-reaktifi). LAL reaktifi spesifik olarak bakteriyel endotoksinlerle reaksiyona girer. Enzimatik reaksiyonun bir sonucu olarak, reaksiyon karışımı endotoksin konsantrasyonu ile orantılı olarak değişir.

Bu testi yürütmek için üç ana metodolojik yaklaşım vardır: jel oluşumuna dayalı jel trombüs yöntemi; LAL reaktifinde bulunan substratın bölünmesinden sonra reaksiyon karışımının bulanıklığına dayanan türbidimetrik yöntem; ve sentetik bir peptit-kromojenik kompleksin bölünmesinden sonra lekelenmenin görünümüne dayanan bir kromojenik yöntem.

Bu makale, yukarıda açıklanan ilkelere dayalı olarak aşağıdaki altı testi açıklamaktadır:

• – Kalitatif jel trombüs testi (Yöntem A);
• – Kantitatif jel trombüs testi (Yöntem B);
• – Türbidimetrik kinetik testi (Yöntem C);
• – Kromojenik kinetik testi (Yöntem D);
• – Kromojenik son nokta testi (Yöntem E);
• – Türbidimetrik Son Nokta Testi (Yöntem F).

Test, verilen altı yöntemden herhangi biri ile gerçekleştirilir. Şüphe veya anlaşmazlık durumunda, nihai sonuç test yöntemi A sırasında elde edilen sonuçlara göre alınır.

Yemekler ve hazırlık

LAL testinde kullanılan cam ve plastik gereçler, testte belirlenen miktarlarda bakteriyel endotoksin içermemeli ve reaksiyonun seyrini etkilememelidir.

Endotoksin Standartları

Tahlil, aktivitesi Uluslararası Endotoksin Standardına göre belirlenmiş bir Referans Endotoksin Standardı (CSE) kullanabilir. CSE, bu LAL reaktifi (veya TAL reaktifi) partisi ile analiz için tasarlanmalıdır. CSE'nin çözülmesi ve saklanması, üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirilir.

LAL reaktifi

Bakteriyel endotoksinlerin belirlenmesi için seçilen yöntem için tasarlanmış bir LAL reaktifi kullanmak gereklidir.

Reaktifin (l) duyarlılığı endotoksin birimleri [EU/ml] cinsinden ifade edilir ve şuna karşılık gelir: minimum konsantrasyon Belirli bir reaktifle (Yöntem A ve B) reaksiyona girdiğinde yoğun bir jel oluşmasına neden olan veya standart eğrideki minimum noktaya karşılık gelen (Yöntem C, D, E ve F) endotoksin için Uluslararası Standart.

Liyofilize LAL reaktifinin seyreltilmesi ve saklanması, üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirilir.

Not: LAL reaktifi, endotoksinlere ek olarak bazı β-glikanlarla da reaksiyona girebilir; bu nedenle glikanlarla reaksiyona giren faktör G'nin çıkarıldığı spesifik bir LAL reaktifi kullanmak mümkündür. Faktör G reaksiyon sistemini bloke eden yardımcı çözeltilere de izin verilir.Bu tür reaktifler, glikanların varlığında endotoksinleri tespit etmek için kullanılabilir.

LAL testi için su

Test edilen tıbbi ürünün reaktif solüsyonları ve dilüsyonlarını hazırlamak için LAL testi için su kullanılır. LAL testi için su, enjeksiyon için su gereksinimlerini karşılamalı ve testte belirlenen miktarlarda bakteriyel endotoksinler içermemelidir.

Test örneğinin hazırlanması

Seçilen her örnek ayrı ayrı test edilir.

Test edilen tıbbi ürünü çözmek ve/veya seyreltmek için, Farmakope Monografında farklı bir çözücü belirtilmediği sürece LAL testi için su kullanın. Test solüsyonu, LAL reaktif üreticisi tarafından belirtilen aralık içinde, tipik olarak 6,0 - 8,0 arasında bir pH değerine sahip olmalıdır. Gerekirse asit, baz çözeltileri veya tampon çözelti kullanılarak pH istenen değere ayarlanır. Kullanılan solüsyonlar testte belirlenen miktarlarda bakteriyel endotoksinler içermemeli ve reaksiyonun seyrini etkilememelidir.

Test edilen tıbbi ürünün izin verilen maksimum seyreltmesi

İzin verilen maksimum dilüsyon (MDR), test edilen tıbbi ürünün, bu tıbbi ürün için belirlenen bakteriyel endotoksinler için belirlenen sınır değere karşılık gelen endotoksin konsantrasyonunun belirlenebildiği en yüksek dilüsyonudur.

Test edilen tıbbi ürün, nihai dilüsyonun aşağıdaki formülle hesaplanan MDR değerini aşmaması koşuluyla, tek bir dilüsyonda veya bir dizi dilüsyonda test edilebilir:

« maksimum bakteriyel endotoksin içeriği”- Farmakope monografında belirtilen, test edilen tıbbi üründe izin verilen bakteriyel endotoksin içeriği;

"test solüsyonunun konsantrasyonu"- maksimum bakteriyel endotoksin içeriğinin belirtildiği tıbbi ürün veya etkin maddenin konsantrasyonu

EU/ml cinsinden LAL reaktifinin duyarlılığıdır.

Bakteriyel endotoksinlerin sınırını hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın:

K, test edilen tıbbi ürün için 1 saatte 5 EU/kg'a eşit olan eşik pirojenik dozdur (hastaya intratekal dışında herhangi bir parenteral yolla uygulanırsa). İlacın intratekal uygulama yolu ile K, 0.2 EU / kg'dır;

M, test ilacının bir saat içinde uygulanan maksimum terapötik dozudur (vücut ağırlığının 1 kg'ı başına mg, ml veya U olarak ifade edilir).

radyofarmasötik için ilaçlar intravenöz olarak uygulandığında, bakteriyel endotoksinlerin maksimum içeriği 175/V olarak hesaplanır; burada V, ml cinsinden önerilen maksimum dozdur. İntratekal olarak uygulanan radyofarmasötikler için bakteriyel endotoksin limiti 14/V'dir.

Dozu vücut yüzeyinin m2'si başına hesaplanan ilaçlar için (örneğin antikanser ilaçlar), eşik pirojenik doz (K) 100 EU/m2'dir.

Jel pıhtı testi (Yöntem A ve B)

Jel pıhtısı yöntemi, numunedeki endotoksinlerin varlığını belirlemenizi veya konsantrasyonunu ölçmenizi sağlar. LAL reaktifinin endotoksin ile reaksiyonu sonucunda, reaksiyon karışımının viskozitesi yoğun bir jel oluşumuna kadar artar.

Testlerin doğruluğunu ve geçerliliğini sağlamak için, LAL reaktifinin beyan edilen hassasiyeti, bölümde açıklandığı gibi, müdahale eden faktörlerin varlığı açısından onaylanmalı ve test edilmelidir. "Ön analiz".

Test prosedürü

Eşit hacimlerde test solüsyonu ve LAL reaktifi (her biri 0,1 ml), 10 mm çapında yuvarlak tabanlı test tüplerine konur. Reaksiyon karışımları nazikçe karıştırılır ve 37 ± 1°C'de 60 ± 2 dakika inkübe edilir. İnkübasyon sırasında titreşim ve şoktan kaçınılmalıdır. Belirlenen süre sonunda sonuçlar görsel olarak pozitif veya negatif olarak kaydedilir. Pozitif reaksiyon (+), tüp bir kez dikkatlice 180° döndürüldüğünde yok edilmeyen yoğun bir jel oluşumu ile karakterize edilir. Negatif bir reaksiyon (-), böyle bir jelin olmaması ile karakterize edilir.

ÖN ANALİZ

LAL reaktifinin beyan edilen hassasiyetinin teyidi

Analiz, kullanılan her yeni LAL reaktifi partisinin yanı sıra deney koşullarını, kullanılan malzemeleri ve test sonuçlarını etkileyebilecek reaktifleri değiştirirken gerçekleştirilir.

prosedür testler

Tablo 1'de gösterilen şemaya göre C ve D Çözümleri.

Tablo 1 - Deneyin şeması "

Çözümler C- LAL testi için su içinde bir dizi CSE dilüsyonu (LAL reaktifinin hassasiyetinin test edilmesi);

Çözüm D

Deney, " bölümünde açıklandığı gibi gerçekleştirilir. Analiz prosedürü».

Sonuçlar ve yorumlama

• - İçin çözüm D(negatif kontrol) tüm kopyalar negatifti;
• - İçin çözüm C 2 l'lik bir konsantrasyonla, elde edilen pozitif sonuçlar;
• - İçin çözüm C 0,25 l'lik bir konsantrasyon ile negatif sonuçlar elde edilmiştir.

Tekrarların her biri için reaksiyon bitiş noktası çözüm C en düşük CSE konsantrasyonuna sahip çözelti için elde edilen pozitif sonuçtur. Bu sonuçlara dayanarak, LAL reaktifinin hassasiyetinin geometrik ortalama değeri aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır:

Nerede:

– replikasyonların her birinde reaksiyonun bitiş noktasındaki CSE konsantrasyonlarının logaritmalarının toplamı;

F tekrar sayısıdır.

LAL reaktifinin beyan edilen hassasiyeti, deneyde elde edilen LAL reaktifinin hassasiyet değeri 0,5'ten az ve 2'den fazla değilse doğrulanmış olarak kabul edilir ve sonraki hesaplamalarda kullanılır.

Engelleyen faktörler

Test edilen ilaç, LAL reaktifinin bakteriyel endotoksinlerle reaksiyonunu artıran ve/veya inhibe eden engelleyici faktörler içerebilir. Bu olaylar, kullanılan LAL reaktifinin LAL testi için suda bir CSE çözeltisiyle ve standart deneysel koşullar altında test edilen ilacın bir çözeltisinde reaksiyona girme yeteneği karşılaştırılarak tespit edilebilir.

İlaç, MDR'yi aşmayan herhangi bir dilüsyonda test edilebilir. Bu analizde kullanılan test ilacı numuneleri (veya dilüsyonları), testte belirlenen miktarlarda bakteriyel endotoksinler içermemelidir.

Test prosedürü

Analiz için A - D çözeltileri Tablo 2'de gösterilen şemaya göre hazırlanır.

Çözüm A– seçilen seyreltmede ilacı test edin (bakteriyel endotoksin yokluğunun kontrolü);

Çözümler B- test edilen ilacın bir solüsyonunda bir dizi CSE dilüsyonu (reaksiyonun inhibisyon veya artış olasılığının saptanması);

Çözümler C– LAL testi (pozitif kontrol) için suda bir dizi CSE seyreltmesi;

ÇözümD- LAL testi için su (negatif kontrol).

Tablo 2 - "Girişen faktörler" deneyinin şeması

Sonuçlar ve yorumlama

Aşağıdaki durumlarda deneyin sonuçları güvenilir kabul edilir: Deney, " bölümünde açıklandığı gibi gerçekleştirilir. Analiz prosedürü».

– İçin çözümler bir Ve D tüm tekrarlarda negatif sonuçlar alındı;

- İçin çözümler C(pozitif kontrol) bakteriyel endotoksinlerin geometrik ortalama konsantrasyonu 0,5'ten az ve 2'den fazla değildir.

Her bir tekrar için elde edilen sonuçlara göre çözümler B, LAL reaktifinin hassasiyetinin geometrik ortalama değerini hesaplayın. Hesaplama, " bölümünde açıklandığı gibi yapılır. LAL reaktifinin beyan edilen hassasiyetinin teyidi". Elde edilen ortalama değer 0,5 l'den az ve 2 l'den fazla değilse, test edilen ilacın seçilen dilüsyonda LAL reaktifinin bakteriyel endotoksinlerle reaksiyonunu inhibe edebilen ve/veya artırabilen engelleyici faktörler içermediği kanıtlanmış kabul edilir. ve bakteriyel endotoksinlerin içeriği için analiz edilebilir.

MW'den daha düşük bir dilüsyonda test edilmiş bir test ilacı için enterferans faktörlerinin varlığı bulunursa, MW'ye eşit bir dilüsyona kadar tahlil daha yüksek bir dilüsyonda tekrarlanır. Çoğu durumda, test edilen ilacın ek seyreltilmesi, müdahale eden faktörlerin etkisini ortadan kaldırabilir. Daha yüksek hassasiyetli bir LAL reaktifinin kullanılması, seyreltme derecesinin arttırılmasına izin verir.

Filtreleme, nötralizasyon, diyaliz veya ısıl işlem gibi uygun numune hazırlama ile engelleyici faktörlerin üstesinden gelinebilir. Etkileşen faktörlerin uzaklaştırılması için seçilen yöntem, test edilen tıbbi üründeki bakteriyel endotoksinlerin konsantrasyonunu değiştirmemelidir, bu nedenle bu tür bir tedaviden önce test edilen tıbbi ürünün solüsyonuna bilinen bir konsantrasyondaki CSE eklenir ve ardından analiz gerçekleştirilir. Engelleyen faktörler». Seçilen yöntemle tedaviden sonra analiz sonuçları tatmin ediciyse, test edilen tıbbi ürün bakteriyel endotoksin içeriği açısından analiz edilebilir.

Test edilen ilaç, müdahale eden faktörlerden arındırılamazsa, LAL testi kullanılarak bakteriyel endotoksinler için test edilemez.

KALİTATİF ANALİZ (Yöntem A)

Bu analizin amacı, test numunesindeki bakteriyel endotoksin içeriğinin, monografta belirtilen bakteriyel endotoksinler için sınır değeri aşmadığını doğrulamaktır.

Test prosedürü

Analiz için hazırlandı Çözümler A -D Tablo 3'te gösterilen şemaya göre.

Çözüm A- test edilen tıbbi ürün, müdahale eden faktörlerin olmadığı bir dilüsyonda veya MDR'yi aşmayan daha yüksek bir dilüsyonda;

Çözüm B- CSE'nin eklendiği, seçilen dilüsyonda test edilen tıbbi ürün. Analiz edilen çözeltideki nihai endotoksin konsantrasyonu 2 olmalıdır (test örneğinin pozitif kontrolü).

Çözüm C– LAL testi için son konsantrasyon 2 (pozitif kontrol) ile suda CSE çözeltisi.

ÇözümD- LAL testi için su (negatif kontrol).

Test, Test Prosedürü bölümünde açıklandığı gibi gerçekleştirilir.

Tablo 3 - "Nitel analiz" deneyinin şeması

Sonuçlar ve yorumlama

Aşağıdaki durumlarda analiz güvenilir kabul edilir:

- İçin çözümD(negatif kontrol) her iki tekrarda da negatif sonuç alınmış,

- İçin çözüm C(pozitif kontrol) tüm tekrarlarda pozitif sonuç alındı,

- İçin çözüm B(pozitif test numunesi kontrolü) her iki tekrarda da pozitif sonuçlar elde edildi.

eğer için çözüm A iki kopya halinde negatif sonuçlar alınırsa, ilacın testi geçtiği kabul edilir.

MW'den daha düşük bir dilüsyonda bir test ürünü iki kez pozitif sonuç verirse, tahlil daha yüksek dilüsyonda veya MW'ye eşit bir dilüsyonda tekrarlanmalıdır.

Test edilen tıbbi ürün için MDR'ye eşit bir dilüsyonda iki tekrarda pozitif sonuçlar elde edilirse, tıbbi ürün Farmakope Monografının "Bakteriyel endotoksinler" bölümünün gerekliliklerini karşılamamaktadır.

Tekrarlardan birinde pozitif sonuç alınırsa çözüm A sonra analiz tekrarlanır. İki kopya için tekrarlanan bir analizde negatif sonuçlar elde edilirse, tıbbi ürünün testi geçtiği kabul edilir.

KANTİTATİF ANALİZ (Yöntem B)

Bu yöntem, test ilacının bir dizi seri dilüsyonunu kullanarak bakteriyel endotoksinlerin içeriğini belirler.

Test prosedürü

Analiz için hazırlandı Çözümler A-D Tablo 4'te gösterilen şemaya göre.

Çözümler A- MDR'yi aşmayan en yüksek dilüsyona kadar, müdahale eden faktörlerin olmadığı dilüsyondan başlayarak, test edilen tıbbi ürünün dilüsyonları.

Çözüm B- CSE çözeltisinin eklendiği A çözeltisinin bir dizi seyreltilmesinden en küçük seyreltme. Analiz edilen çözeltideki nihai endotoksin konsantrasyonu 2 olmalıdır (test örneğinin pozitif kontrolü).

Çözümler C– LAL testi (pozitif kontrol) için su içinde bir dizi CSE dilüsyonu.

Çözüm D- LAL testi için su (negatif kontrol).

Analiz, " bölümünde açıklandığı gibi gerçekleştirilir. Analiz prosedürü».

Tablo 4 — "Kantitatif analiz" deneyinin şeması

Sonuçlar ve yorumlama

Aşağıdaki durumlarda analiz güvenilir kabul edilir:

- İçin çözümD(negatif kontrol) negatif sonuçlar iki kez elde edildi,

- İçin çözümler C(pozitif kontrol) bakteriyel endotoksinlerin geometrik ortalama konsantrasyonu 0,5'ten az ve 2'den fazla değildir.

- İçin çözüm B(test örneğinin pozitif kontrolü) pozitif sonuçlar iki kez alınır,

İçin çözümler bir reaksiyonun bitiş noktası, test edilen ilacın en yüksek dilüsyonu için elde edilen pozitif sonuçtur.

Bu seyreltme faktörünün ürününün LAL reaktifinin (l) duyarlılık değerine göre değeri, içindeki endotoksin konsantrasyonuna eşittir. çözüm A Bu tekrar için elde edilen Endotoksin konsantrasyonunun geometrik ortalama değeri " bölümünde açıklandığı gibi hesaplanır. LAL reaktifinin beyan edilen hassasiyetinin teyidi".

Serinin tüm tekrarlarında ise çözümler bir negatif sonuçlar elde edilirse, test edilen tıbbi üründeki bakteriyel endotoksinlerin konsantrasyonu, ürünün LAL reaktifinin duyarlılık değerinden ve en küçük dilüsyon faktöründen daha azdır. Serinin tüm tekrarlarında ise çözümler bir pozitif sonuçlar elde edilirse, test edilen tıbbi üründeki bakteriyel endotoksinlerin konsantrasyonu, LAL reaktifinin duyarlılığının ve en büyük dilüsyon faktörünün ürününden daha fazladır.

Deneyde belirlenen bakteriyel endotoksin içeriğinin ortalama değeri, Farmakope Monografında belirtilen bakteriyel endotoksin içeriği sınır değerinden düşükse, tıbbi ürünün testi geçtiği kabul edilir. .

FOTOMETRİK YÖNTEMLER (YöntemlerC, D, EVeF) TURBİDİMETRİK YÖNTEMLER (CVeF)

Türbidimetrik yöntemler, reaksiyon karışımının bulanıklık derecesinin ölçülmesine dayanan fotometrik yöntemleri ifade eder. Testin altında yatan ilkeye bağlı olarak bu yöntem, türbidimetrik son nokta testi veya türbidimetrik kinetik analiz olarak gerçekleştirilebilir.

Bulanıklık son nokta testi (Yöntem F), sondaki reaksiyon karışımının bulanıklık derecesinin ölçülmesine dayanır. kuluçka süresi endotoksin konsantrasyonuna bağlıdır.

Türbidimetrik kinetik test (Yöntem C), belirli bir absorbans değerine ulaşmak için gereken süre ile ölçülen bir reaksiyon karışımındaki bulanıklık gelişim hızının belirlenmesine dayanır.

KROMOJENİK YÖNTEMLER (D ve E)

Kromojenik yöntemler, endotoksinlerin bir LAL reaktifi ile reaksiyonu sonucunda kromojenik bir substrattan salınan bir kromofor miktarını ölçmek için kullanılır. Testin altında yatan prensibe bağlı olarak, bu yöntem bir kromojenik son nokta testi veya bir kromojenik kinetik deney olarak gerçekleştirilebilir.

Kromojenik uç nokta testi (Yöntem E), inkübasyon süresinin sonunda salınan kromofor miktarına bağlı olarak reaksiyon karışımının renk yoğunluğunun ölçülmesine dayanır. Serbest bırakılan kromofor miktarı endotoksin konsantrasyonuna bağlıdır.

Kromojenik kinetik test (yöntem D), reaksiyon karışımının belirli bir optik yoğunluk değerine ulaşmak için gereken süre ile ölçülen, reaksiyon karışımının renginin gelişme hızını belirler.

Test, LAL reaktifi üreticisi tarafından önerilen inkübasyon sıcaklığında (tipik olarak 37 ± 1°C) gerçekleştirilir.

ÖN ANALİZ

Türbidimetrik veya kromojenik testin güvenilirliğini ve doğruluğunu doğrulamak için, standart eğri kriterlerinin geçerli olduğundan ve test solüsyonunun reaksiyona müdahale eden faktörler içermediğinden emin olmak için ön analizler yapılır.

Deneyin sonuçlarını etkileyebilecek herhangi bir değişiklik yaparken, testin güvenilirliği ve doğruluğuna ilişkin ek onay gereklidir.

Standart Eğri Kriterlerinin Doğrulanması

Analiz, her yeni LAL reaktif partisi için gerçekleştirilir.

Standart bir eğri oluşturmak için, LAL reaktifi üreticisinin tavsiyelerine uygun olarak ilk CSE solüsyonundan en az üç farklı endotoksin konsantrasyonu hazırlanır. Analiz, LAL reaktifi üreticisi tarafından belirtilen koşullar altında (hacim oranları, inkübasyon süresi, sıcaklık, pH, vb.) en az üç kopya halinde gerçekleştirilir.

Kinetik yöntemlerde, bir lg endotoksin konsantrasyonu başına ölçüm aralığındaki her değişiklik için 2 lg endotoksin konsantrasyonundan daha büyük bir CSE aralığı ile standart bir eğri oluşturmak gerekiyorsa, deney tasarımına uygun konsantrasyonda bir CSE çözeltisi dahil edilmelidir. .

Test edilen endotoksin konsantrasyon aralığı için korelasyon katsayısının mutlak değeri |r| 0,980'e eşit veya daha büyük olmalıdır.

Engelleyen faktörler

İlaç, MDR'yi aşmayan herhangi bir dilüsyonda test edilebilir.

Test prosedürü

A'dan D'ye kadar olan çözeltileri Tablo 5'te belirtildiği gibi hazırlayın. A, B, C ve D çözeltilerini LAL reaktifi üreticisinin tavsiyelerine göre en az iki kopya halinde test edin (test ilacı ve LAL reaktifinin hacimleri ve hacim oranları, inkübasyon süresi, sıcaklık, pH, vb.).

Tablo 5 - "Girişen faktörler" deneyinin şeması

Çözüm A- MDR değerini aşmayan bir dilüsyonda test edilen tıbbi ürünün bir çözeltisi;

Çözüm B- CSE'nin eklendiği, seçilen dilüsyonda test edilen tıbbi ürün. Analiz edilen çözeltideki nihai endotoksin konsantrasyonu, standart eğriyi (test örneğinin pozitif kontrolü) oluşturmak için kullanılan CSE konsantrasyonlarının ortalama değerine karşılık gelmeli veya bu değere yakın olmalıdır;

Çözümler C- "Standart eğri kriterlerinin güvenilirliğinin kontrol edilmesi" (pozitif kontrol) analizinde kullanılanlarla aynı konsantrasyonlarda standart eğri oluşturmak için kullanılan CSE çözümleri;

Çözüm D - LAL testi için su (negatif kontrol).

– standart eğri için elde edilen sonuçlar (Çözüm C), "Standart eğri için kriterlerin doğrulanması" bölümünde belirtilen geçerlilik gereksinimlerini karşılar;

- D solüsyonu (negatif kontrol) için elde edilen sonuç, kullanılan LAL reaktifi için talimatlarda belirtilen değeri aşmaz veya kullanılan yöntemle belirlenen endotoksin konsantrasyonundan az değildir.

Deneyde elde edilen eklenen endotoksin konsantrasyonunun ortalama değeri, içindeki endotoksin konsantrasyonunun ortalama değerinden çıkarılarak hesaplanır. çözüm B(ilave endotoksin içeren) içindeki endotoksin konsantrasyonunun ortalama değeri çözüm A(mümkün ise).

Bir test çözeltisinin, test koşulları altında, test çözeltisine eklenen ölçülen endotoksin konsantrasyonunun, eklenen endotoksinin bilinen konsantrasyonunun %50-200'ü kadar olması halinde, engelleyici faktörler içermediği kabul edilir.

Deneyde belirlenen endotoksin konsantrasyonu belirtilen sınırlar içinde değilse, test preparatının reaksiyona müdahale eden faktörler içerdiği sonucuna varılır. Bu durumda deney, MDR'ye eşit bir dilüsyona kadar daha yüksek bir dilüsyonda tekrarlanabilir. Test preparasyonunun daha yüksek seyreltilmesine ek olarak, engelleyici faktörlerin etkisi, örneğin filtrasyon, nötralizasyon, diyaliz veya sıcaklık tedavisi gibi uygun işlemlerle giderilebilir. Müdahale faktörlerini ortadan kaldırmak için seçilen yöntem, test edilen tıbbi üründeki bakteriyel endotoksinlerin konsantrasyonunda bir azalmaya yol açmamalıdır, bu nedenle, bu tür bir tedaviyi gerçekleştirmeden önce, test edilen çözeltiye önce bilinen bir konsantrasyona sahip bir CSE çözeltisi eklenmelidir ve daha sonra "Enterferans Faktörleri" analizi tekrarlanmalıdır. Seçilen yöntemle tedaviden sonra analiz sonuçları tatmin ediciyse, test edilen tıbbi ürün bakteriyel endotoksin içeriği açısından analiz edilebilir.

test yapmak

Test prosedürü

Test, "Girişen faktörler" bölümünde verilen prosedüre uygun olarak gerçekleştirilir.

sonuçlar

İçin çözüm A her kopyada, endotoksin konsantrasyonu, bir dizi CSE seyreltisinden elde edilen standart bir eğri kullanılarak belirlenir ( Çözüm C).

Test, aşağıdaki koşullar yerine getirildiğinde geçerli kabul edilir:

1. standart eğri için elde edilen sonuçlar ( Çözümler C), "" bölümünde belirtilen güvenilirlik gereksinimlerini karşılayın. Standart Eğri için Kriterlerin Doğrulanması»;
2. Deneysel olarak belirlenmiş endotoksin konsantrasyonu eklendi çözüm B belirlenen endotoksin konsantrasyon değerini çıkardıktan sonra çözüm A, bilinen değerin %50 ila %200'ü aralığındadır;
3. için elde edilen sonuç çözüm D(negatif kontrol) kullanılan LAL reaktifi için talimatlarda belirtilen değeri aşmaz veya kullanılan yöntemle belirlenen endotoksin konsantrasyonundan az değildir.

Sonuçların yorumlanması

Deneyde tekrarlanan bakteriyel endotoksin içeriğinin ortalama değeri belirlenirse ilacın testi geçtiği kabul edilir. çözüm A(test edilen ilacın seyreltilmesi ve konsantrasyonu dikkate alınarak) monografta belirtilen bakteriyel endotoksinlerin sınır değerinden daha az.

Not: Endotoksin kontrol standardı ve LAL reaktifi veya TAL reaktifi, Rusya Federasyonu Sağlık Bakanlığı'na kayıtlı olmalıdır.

GPM.1.2.4.0006.15 Bakteriyel endotoksinler

Rusya Federasyonu Sağlık Bakanlığı

Genel Farmakope Monografisi

Bakteriyel endotoksinler GPM.1.2.4.0006.15
Rusya Federasyonu Devlet Farmakopesi XII, Bölüm 1 Monografi, GPM 42-0062-07'nin yerine geçer

Mevcut Genel Farmakope Monografisi, parenteral uygulama için tasarlanmış tıbbi ürünlerdeki bakteriyel endotoksinleri saptamak için kullanılan yöntemleri ve bu tür ürünleri üretmek için kullanılan ilaç maddelerini açıklamaktadır.

Bakteriyel endotoksin tahlili, at nalı yengecinden kan hücrelerinin (amoebositler) bir lizatını sunan bir reaktif kullanılarak gerçekleştirilir: Limulus polyphemus (LAL reaktifi) veya Tachypleus tridentatus (TAL reaktifi)). LAL reaktifleri özellikle bakteriyel endotoksinlerle etkileşime girer. Bir enzimatik reaksiyonun sonucu olarak, reaktan karışımı endotoksin konsantrasyonuyla orantılı bir değişime uğrar.

Bu testi gerçekleştirmek için üç ana metodolojik yaklaşım vardır: jel oluşumuna dayalı jel kumaş tahlili; LAL reaktifinde bulunan substratın bozunmasından sonra reaktan karışımının bulanıklaştığı türbidimetrik prensip; ve sentetik bir peptit - kromojenik kompleksin bozunmasıyla indüklenen renge dayanan kromojenik prensip.

Mevcut Farmakope Monografisi, yukarıda bahsedilen ilkelere dayalı olarak aşağıdaki altı testi açıklamaktadır:

– Kalitatif jel pıhtı tahlili (Yöntem A);

– Kantitatif jel pıhtı tahlili (Yöntem B);

– Türbidimetrik kinetik testi (Yöntem C);

– Kromojenik kinetik testi (Yöntem D);

– Kromojenik uç nokta deneyi (Yöntem E);

– Türbidimetrik uç nokta testi (Yöntem F).

Test, yukarıda belirtilen altı yöntemden herhangi biri kullanılarak gerçekleştirilebilir. Herhangi bir şüphe veya tutarsızlık olması durumunda, nihai sonuç, Yöntem A kullanılarak elde edilen sonuçlara dayanılarak yapılmalıdır.

Laboratuvar gereçleri ve hazırlanışları

plastikler ve plastikler.

Önerilen depirojenasyon rejimi, onaylanmış prosedüre göre en az 30 dakika boyunca 250 °C sıcaklıkta ısıtmadır.

endotoksin standartları

Bakteriyel endotoksinlerin içeriği, Uluslararası Endotoksin Standardının Endotoksin Birimleri (AB) cinsinden ifade edilir. Bir endotoksin Uluslararası Birimi (IU), bir AB'ye karşılık gelir.

Analiz ayrıca Endotoksin Referans Standardına (ERS) dayalı olabilir; aktivitesi, endotoksinler için Uluslararası Standarda göre oluşturulmuştur. Belirli bir LAL-reaktifi (TAL-reaktifi) lotunun test edilmesi için bir Endotoksin Referans Standardı tasarlanmalıdır. ERS'nin çözülmesi ve saklanması, üreticinin Kullanım Talimatlarına göre gerçekleştirilir.

LAL reaktifi

Seçilen bakteriyel endotoksin test yöntemi için tasarlanmış LAL reaktifi kullanılmalıdır.

LAL-reaktif duyarlılığı (λ), endotoksin birimleri cinsinden ifade edilir ve belirli LAL-reaktifi ile reaksiyona girerken yoğun bir jel oluşumunu destekleyen minimum Uluslararası Endotoksin Standardı konsantrasyonuna karşılık gelir (Yöntem A ve B) veya minimum değere karşılık gelir standart eğri üzerindeki nokta (Yöntemler C, D, E ve F).

Liyofilize LAL reaktifinin çözünmesi ve saklanması, üreticinin Kullanım Talimatlarına uygun olarak gerçekleştirilir.

Not: Endotoksinlerin dışında, bir LAL reaktifi de bazılarıyla reaksiyona girebilir.β -glikanlar ve dolayısıyla glikanlarla reaksiyona giren G faktöründen yoksun spesifik bir LAL reaktifi kullanılabilir. G faktörü reaksiyona giren sistemi bloke eden aksesuar çözümlerinin kullanımına da izin verilir. Bu reaktifler, glikanların varlığında endotoksinlerin belirlenmesi için kullanılabilir.

LAL testi için su

LAL testi için su, test edilen tıbbi ürünün tüm reaktiflerinin ve dilüsyonlarının hazırlanmasında kullanılır. LAL- omuzlama suları ve en yüksek miktarlarda in-

Test edilen numunenin hazırlanması

Seçilen her numune ayrı ayrı test edilmelidir.

LAL testi için su, Farmakope Monografında aksi belirtilmedikçe, test edilen tıbbi ürünü çözmek ve/veya seyreltmek için kullanılır. Test edilen çözeltinin pH değeri, LAL reaktifi üreticisi tarafından belirtilen aralık içinde, en yaygın olarak 6,0 – 8,0 olmalıdır. Gerektiğinde, test edilen çözeltinin pH değeri asidik veya bazik çözeltiler veya bir tampon çözelti kullanılarak ayarlanır. içeriği hariç, kullanılan

Test edilen tıbbi ürünün maksimum kabul edilebilir dilüsyonu

Kabul edilebilir maksimum dilüsyon (MAD), belirli bir tıbbi ürün için onaylanmış bakteriyel endotoksinlerin maksimum içeriğine karşılık gelen endotoksin konsantrasyonunun tespit edilebildiği, test edilen tıbbi ürünün en yüksek dilüsyonudur.

Test edilen tıbbi ürün, nihai dilüsyonun aşağıdaki denkleme göre hesaplanan MAD değerini aşmaması kaydıyla, tek dilüsyonda veya bir dizi dilüsyonda test edilebilir:

Neresi: " bakteriyel endotoksinlerin maksimum içeriği”, Farmakope Monografında belirtildiği gibi, test edilen tıbbi üründeki kabul edilebilir bakteriyel endotoksin içeriğidir;

“test edilen çözeltinin konsantrasyonu”, bakteriyel endotoksinlerin maksimum içeriğinin belirlendiği tıbbi ürün veya aktif bileşenin konsantrasyonudur;

λ, LAL reaktifinin hassasiyetidir (EU/mL).

Bakteriyel endotoksinlerin maksimum içeriğini hesaplamak için aşağıdaki denklem kullanılır:

burada: K, test edilen tıbbi ürün için saatte 5 EU/kg'a eşit olan eşik pirojenik dozdur (sonuncusu hastalara intratekal yol dışında herhangi bir parenteral yoldan uygulanıyorsa). İlaç intratekal yoldan verilirse, K değeri 0,2 EU/kg'dır;

M — test edilen tıbbi ürünün bir saatlik bir süre boyunca uygulanan maksimum terapötik dozu (mg, mL veya vücut ağırlığının kilogramı başına birim olarak ifade edilir).

İntravenöz olarak uygulanan radyofarmasötik tıbbi ürünler için, bakteriyel endotoksinlerin maksimum içeriği 175 / V olarak hesaplanır, burada V, önerilen maksimum dozdur (mL). İntratekal olarak uygulanan radyofarmasötik tıbbi ürünler için bakteriyel endotoksinlerin maksimum içeriği 14 / V olarak hesaplanır.

Tıbbi ürünün dozları vücut yüzey alanının metrekaresi başına ifade ediliyorsa (antineoplastik ilaçlar gibi), eşik pirojenik doz (K) 100 EU/m2 olarak belirlenir.

Jel kumaş tahlili (YöntemlerAVeİÇİNDE)

Jel kumaş yöntemi, bir numunedeki endotoksinlerin saptanmasına veya miktarının belirlenmesine izin verir. LAL reaktifi ile endotoksin arasındaki reaksiyon, yoğun bir jel oluşana kadar reaksiyon karışımının viskozitesinde bir artışa neden olur.

Test sonuçlarının doğruluğunu ve güvenilirliğini sağlamak için, LAL reaktifinin beyan edilen hassasiyeti doğrulanmalı ve "" bölümünde açıklandığı gibi müdahale eden faktörlerin varlığına yönelik bir test yapılmalıdır. hazırlık testi" bölüm .

Açıklama Prosedür. Eşit hacimlerde test edilen çözelti ve LAL reaktifini (her biri 0,1 mL) 10 mm çapında yuvarlak tabanlı test tüplerine aktarın. Reaksiyon karışımlarını dikkatlice karıştırın ve 37 ± 1 °C sıcaklıkta 60 ± 2 dakikada inkübe edin. İnkübasyon sırasında titreşim ve mekanik şoklardan kaçınılmalıdır. Belirlenen süre sonunda sonuçlar gözle muayene ile pozitif veya negatif olarak değerlendirilir. Pozitif reaksiyon (+), test tüpünün tek bir dikkatli 180° döndürülmesiyle yok edilmeyen yoğun bir jel oluşumu ile karakterize edilir. Negatif bir reaksiyon (-), böyle bir jelin olmaması ile karakterize edilir.

HAZIRLIK TESTİ

Bu analiz, kullanılan LAL reaktifinin her yeni partisi için ve ayrıca deney koşullarında, kullanılan malzemelerde ve reaktiflerde test sonuçlarını etkileyebilecek herhangi bir değişiklik olduğunda gerçekleştirilir.

Açıklama Prosedür. Bu test için, C ve D çözeltileri Tablo 1'in gerekliliklerine göre hazırlanır.

Tablo 1- Deney tasarımı, "İddia edilen LAL-reaktif duyarlılığının doğrulanması"

bu Çözümler C serisi, LAL testi (LAL-reaktif duyarlılık doğrulaması) için Suda ERS dilüsyonlarından oluşur;

Çözüm D

Test, "Prosedür açıklaması" bölümünde açıklandığı gibi gerçekleştirilir.

sonuçlar ve yorumlama Aşağıdaki koşullar yerine getirildiğinde bir analiz geçerli kabul edilir:

için Çözüm D(negatif kontrol) - tüm test kopyalarında negatif sonuçlar elde edilir;

için Çözüm C 2λ konsantrasyonu ile – pozitif sonuçlar elde edilir;

için Çözüm C 0,25λ konsantrasyonu ile - negatif sonuçlar elde edilir.

Her kopya için reaksiyon bitiş noktası Çözümler C serisi, ERS konsantrasyonu en düşük olan çözelti için elde edilen pozitif bir sonuçtur. Bu sonuçlar, LAL-reaktif duyarlılığının geometrik ortalama değerini hesaplamak için kullanılır; hesaplama aşağıdaki denkleme göre yapılır:

Reaksiyon bitiş noktasındaki ERS konsantrasyonlarının geometrik ortalaması

=

antilog (),

burada: e, kopyaların her birinde reaksiyon bitiş noktalarındaki ERS konsantrasyonlarının logaritmalarının toplamıdır;

F tekrar sayısıdır.

Beyan edilen LAL-reaktif duyarlılığının doğrulanmış olduğu kabul edilir ve testte elde edilen LAL-reaktif duyarlılığı değerinin 0,5λ'nın altında olmaması ve 2λ'yı aşmaması şartıyla sonraki hesaplamalarda kullanılabilir.

Engelleyen faktörler

Test edilen tıbbi ürün, LAL reaktifinin bakteriyel endotoksinlerle reaksiyonunu yoğunlaştıran ve/veya inhibe eden engelleyici faktörler içerebilir. Bu olaylar, kullanılan LAL reaktifinin LAL testi için Su içindeki ERS solüsyonu ve standart deney koşulları altında test edilen tıbbi ürün solüsyonu ile reaksiyona girme yeteneğinin karşılaştırılmasıyla tanınabilir.

Bir tıbbi ürün, MAD değerini aşmayan herhangi bir dilüsyonda test edilebilir. bu

açıklama prosedürü . Bu analiz için A – D Çözümleri Tablo 2'de yer alan gerekliliklere göre hazırlanır.

Çözüm A– seçilen dilüsyonda test edilen tıbbi ürün (bakteriyel endotoksinlerin yokluğuna yönelik kontrol).

Çözümler B– test edilen tıbbi ürünün solüsyonundaki ERS dilüsyonları serisi (reaksiyon inhibisyonu veya yoğunlaşma olasılığını saptayan test).

Çözümler C

Çözüm D– LAL testi için su (negatif kontrol).

Tablo 2-

Bu test “ bölümünde açıklandığı gibi yapılmalıdır. açıklama prosedürü"bölüm.

sonuçlar ve yorumlama. Aşağıdaki koşullar karşılanırsa bir test güvenilir kabul edilebilir:

• için A ve D Çözümleri- tüm kopyalarda negatif sonuçlar elde edilir;
• için Çözümler C(pozitif kontrol) – bakteriyel endotoksin konsantrasyonunun geometrik ortalama değeri 0,5λ'dan az ve 2λ'dan fazla olmamalıdır.

Her kopyada elde edilen sonuçlar Çözümler B LAL-reaktif duyarlılığının geometrik ortalama değerini hesaplamak için seriler kullanılır. Hesaplama “ bölümünde açıklandığı gibi yapılır. Talep edilen LAL-reaktif duyarlılığının teyidi"bölüm. Elde edilen ortalama duyarlılık değeri 0,5λ'dan az ve 2λ'dan fazla değilse, bu, test edilen tıbbi ürünün söz konusu seyreltmede LAL reaktifinin reaksiyonunu inhibe edebilecek ve/veya yoğunlaştırabilecek herhangi bir engelleyici faktör içermediği anlamına gelir. bakteriyel endotoksinler içerir ve bu nedenle bakteriyel endotoksin içeriği için analiz edilebilir.

MAD'den daha düşük bir dilüsyonda analiz edilen test edilen tıbbi ürün için interferans faktörlerinin varlığı gösterilmişse, test MAD'ye eşit dilüsyona kadar daha yüksek bir dilüsyon için tekrarlanmalıdır. Çoğu durumda, test edilen tıbbi ürünün ilave seyreltilmesi, müdahale eden faktörlerin etkilerini ortadan kaldırabilir. Daha yüksek duyarlılığa sahip bir LAL reaktifinin kullanılması seyreltme derecesini artırmaya izin verecektir.

Engelleyici faktörlerin etkileri, filtrasyon, nötralizasyon, diyaliz veya sıcaklık işleme gibi uygun numune hazırlama ile aşılabilir. Etkileşen faktörleri ortadan kaldırmak için seçilen yöntem, test edilen tıbbi üründeki bakteriyel endotoksinlerin konsantrasyonunu değiştirmemelidir ve bu nedenle, bilinen konsantrasyona sahip ERS, bu tür işlemlerden önce, Etkileşen Faktörler analizi yapılırken test edilen tıbbi ürünün solüsyonuna eklenir. sonra çıkar. Seçilen işleme yöntemi, Engelleyen Faktörler testinin tatmin edici sonuçlarıyla ilişkiliyse, test edilen tıbbi ürün, bakteriyel endotoksin içeriği açısından analiz edilebilir.

Etkileşen faktörler test edilen tıbbi üründen uzaklaştırılamazsa, tıbbi ürün LAL testi kullanılarak bakteriyel endotoksin içeriği açısından test edilemez.

KALİTATİF ANALİZ (Yöntem A)

Bu analizin amacı, test edilen tıbbi ürün örneğindeki bakteriyel endotoksin içeriğinin Farmakope Monografında belirtilen Maksimum Bakteriyel Endotoksin İçeriğini aşmadığını göstermektir.

Açıklama Prosedür. Bu analiz için, Çözümler A-D Tablo 3'te sunulan gereksinimlere göre hazırlanmalıdır.

Çözüm A- MAD değerini aşmaması kaydıyla, hiçbir müdahale edici faktör içermeyen dilüsyonda veya daha yüksek bir dilüsyonda test edilen tıbbi ürün.

Çözüm B– Endotoksin Referans Standardı eklenmiş seçilen dilüsyonda test edilen tıbbi ürün. Analiz edilen solüsyondaki nihai endotoksin konsantrasyonu 2λ (test edilen tıbbi ürünün pozitif kontrolü) olmalıdır.

Çözüm C– son konsantrasyon 2λ (pozitif kontrol) ile LAL testi için Su içinde ERS çözeltisi.

Çözüm D– LAL testi için su (negatif kontrol).

Tablo 3 - Deney tasarımı, “Nitel analiz”

sonuçlar ve yorumlama .

• için Çözüm D
• için Çözüm C(pozitif kontrol) – tüm tekrarlarda pozitif sonuçlar elde edilir;
• için Çözüm B(test edilen örneğin pozitif kontrolü) - her iki kopyada da pozitif sonuçlar elde edilir.

Olumsuz sonuç alınırsa Çözüm A her iki kopyada da, tıbbi ürün testin gereklerini karşılamaktadır.

Test edilen tıbbi ürünün MAD'den daha az dilüsyonu için her iki tekrarda pozitif sonuç elde edilirse, daha yüksek bir dilüsyon veya MAD'ye eşit dilüsyon için test tekrarlanmalıdır.

Test edilen tıbbi ürünün MAD'ye eşit dilüsyonu için her iki tekrarda pozitif sonuç elde edilirse, söz konusu tıbbi ürün, Farmakope Monografisi'nin Bakteriyel Endotoksinler Bölümü gerekliliklerine uygun değildir.

Tekrarlardan biri için pozitif bir sonuç elde edilirse, Çözüm A, bir tekrar testi yapılmalıdır. İkinci testte her iki tekrar için de negatif sonuç alınırsa, böyle bir tıbbi ürün testi geçmiştir.

KANTİTATİF ANALİZ (Yöntem B)

Bu yöntem, test edilen tıbbi ürünün bir dizi başarılı dilüsyonunu kullanarak bakteriyel endotoksinlerin içeriğini belirlemeye yarar.

Açıklama Prosedür. Bu analiz için, Çözümler A-D Tablo 4'te sunulan gereksinimlere göre hazırlanmalıdır.

Çözümler A- MAD değerini aşmayan en yüksek dilüsyona müdahale eden faktörler içermeyen dilüsyondan başlayarak, test edilen tıbbi ürünün dilüsyonları.

Çözüm B– ERS solüsyonunun eklendiği Solüsyon A seri dilüsyonlarının en düşük dilüsyonu. Analiz edilen çözeltideki son endotoksin konsantrasyonu 2λ olmalıdır (test edilen numunenin pozitif kontrolü).

Çözümler C– LAL testi (pozitif kontrol) için Suda ERS dilüsyonları serisi.

Çözüm D– LAL testi için su (negatif kontrol).

Bu analiz, "Prosedür açıklaması" bölümünde açıklandığı gibi gerçekleştirilir.

Tablo 4 — Deney tasarımı, “Kantitatif analiz”

sonuçlar ve yorumlama. Aşağıdaki koşullar yerine getirildiğinde bir test güvenilir kabul edilmelidir:

• için Çözüm D(negatif kontrol) – her iki kopyada da negatif sonuçlar elde edilir;
• için Çözümler C seri (pozitif kontrol) — bakteriyel endotoksin konsantrasyonunun geometrik ortalama değeri 0,5λ'dan az ve 2λ'dan fazla olmamalıdır;
• için Çözüm B(test edilen numunenin pozitif kontrolü) – iki tekrarda pozitif sonuçlar elde edilir;
• için Çözümler A seri – son nokta reaksiyonu, test edilen tıbbi ürünün en yüksek dilüsyonu için elde edilen pozitif bir sonuçtur.

LAL-reaktif duyarlılık değeri (λ) ile çarpılan ilgili seyreltme faktörü, içindeki endotoksin konsantrasyonuna eşittir. Çözüm A bu özel kopya için elde edilmiştir.

Endotoksin konsantrasyonunun geometrik ortalama değeri, " Talep edilen LAL-reaktif duyarlılığının teyidi"bölüm.

Tüm tekrarlar için negatif sonuçlar elde edilirse Çözümler A serisinde, test edilen tıbbi üründeki bakteriyel endotoksin konsantrasyonu, en düşük dilüsyon faktörü ile çarpılan LAL-reaktif duyarlılık değerinin altındadır. Tüm tekrarlar için pozitif sonuçlar elde edilirse, Çözümler A serisinde, test edilen tıbbi üründeki bakteriyel endotoksin konsantrasyonu, en yüksek seyreltme faktörü ile çarpılan LAL-reaktif duyarlılık değerinin üzerindedir.

Bir tıbbi ürün, test tarafından üretilen ortalama bakteriyel endotoksin içeriği değeri Farmakope Monografında belirtilen Maksimum Bakteriyel Endotoksin İçeriği değerinin altındaysa testi geçmiştir.

FOTOMETRİK YÖNTEMLER (Yöntem C, D, E ve F)

TURBİDİMETRİK YÖNTEMLER (C ve F)

Türbidimetrik yöntemler, reaksiyon karışımının bulanıklığının ölçülmesine dayalı fotometrik yöntemlerin bir çeşididir. Testin altında yatan ilkeye bağlı olarak bu yöntem, uç nokta türbidimetrik test veya kinetik türbidimetrik test olarak gerçekleştirilebilir.

Uç nokta türbidimetrik testi (Yöntem F), endotoksin konsantrasyonuna bağlı olarak inkübasyon süresinin sonunda reaksiyon karışımının bulanıklığının ölçülmesine dayanır.

Kinetik türbidimetrik deney (Yöntem C), bir hedef optik yoğunluk değerine ulaşmak için gereken süre ile değerlendirilen reaksiyon karışımının bulanıklık gelişim hızının belirlenmesine dayanır.

KROMOJENİK YÖNTEMLER (D ve E)

Kromojenik yöntemler, endotoksinler ve LAL reaktifi arasındaki reaksiyonun bir sonucu olarak kromojenik bir substrattan salınan kromofor miktarını belirlemek için kullanılır. Testin altında yatan ilkeye bağlı olarak, bu yöntem ya bir son nokta kromojenik testi ya da kinetik bir kromojenik tahlil olarak gerçekleştirilebilir.

Son nokta kromojenik testi (Yöntem E), inkübasyon süresinin sonunda salınan kromofor miktarına bağlı olarak reaksiyon karışımının renk yoğunluğunun ölçülmesine dayanır. Serbest bırakılan kromofor miktarı endotoksin konsantrasyonuna bağlıdır.

Kinetik kromojenik deney (Yöntem D) sırasında, reaksiyon karışımının renginin gelişme hızı belirlenir; hedef reaksiyon karışımı optik yoğunluk değerine ulaşmak için gereken süre ile değerlendirilir.

Bu test, LAL reaktifi üreticisi tarafından önerilen inkübasyon sıcaklığında (genellikle 37 ± 1°C) gerçekleştirilir.

HAZIRLIK TESTİ

Türbidimetrik veya kromojenik yöntemle elde edilen test sonuçlarının doğruluğunu ve güvenilirliğini göstermek için, standart eğri kriterlerinin güvenilir olduğundan ve test edilen solüsyonun reaksiyonun seyrini engelleyen hiçbir faktör içermediğinden emin olmak için ön testler yapılmalıdır.

Bu deneyin sonuçlarını etkileyebilecek herhangi bir değişiklik, bu testin güvenilirliğinin ve doğruluğunun ek olarak onaylanmasını gerektirir.

Bu analiz, her yeni LAL reaktif grubu için yapılmalıdır.

Standart bir eğri elde etmek için, LAL reaktifi üreticisinin tavsiyelerine uygun olarak stok ERS solüsyonundan en az üç farklı endotoksin konsantrasyonu hazırlanmalıdır. Test, LAL reaktifi üreticisi tarafından tavsiye edilen koşullar altında (hacim oranları, inkübasyon süresi, sıcaklık, pH değeri, vb.) en az tekrarlarla yapılmalıdır.

Bir kinetik yöntemin prosedürü, bir endotoksin konsantrasyon değeri lg'nin her bir ölçüm aralığı değişikliği için endotoksin konsantrasyon değerinin 2 lg'sini aşan bir ERS aralığına sahip standart bir eğri gerektiriyorsa, bunun tasarımına uygun konsantrasyonda bir ERS çözeltisi dahil edilmelidir. deney.

Mutlak korelasyon katsayısı |r| İncelenen endotoksin konsantrasyon aralığı için değer 0,980'e eşit veya daha fazla olmalıdır.

Engelleyen faktörler

Test, MAD değerini aşmayan herhangi bir dilüsyonda herhangi bir tıbbi ürün üzerinde yapılabilir.

Açıklama Prosedür. A – D Solüsyonları Tablo 5'te belirtildiği gibi hazırlanmalıdır. A, B, C ve D Solüsyonları, LAL reaktifi üreticisinin tavsiyelerine göre (test edilen tıbbi ürünün hacimleri ve hacim oranları) en az iki kopya üzerinde test edilmelidir. ürün ve LAL reaktifi, inkübasyon süresi, sıcaklık, pH değeri vb.).

Tablo 5 - Deney tasarımı, Engelleyen faktörler

çözümA- MAD değerini aşmayan bir dilüsyonda test edilen tıbbi ürünün solüsyonu;

çözümİÇİNDE- ERS'nin eklenmesi üzerine seçilen dilüsyonda test edilen tıbbi ürün. Analiz edilen çözeltinin nihai endotoksin konsantrasyonu, standart eğriyi çizmek için kullanılan ERS konsantrasyonlarının ortalama değerine eşit veya bu değere yakın olmalıdır (test edilen numunenin pozitif kontrolü);

ÇözümlerİLE- " sırasında kullanılan aynı konsantrasyonlarda standart eğriyi çizmek için kullanılan ERS çözeltileri Standart eğri kriterleri güvenilirlik kontrolü" (pozitif kontrol);

Çözüm D - LAL testi için su (negatif kontrol).

– standart eğri için elde edilen sonuçlar (Çözüm C), "Standart eğri kriterleri güvenilirlik kontrolü" bölümü için belirlenen güvenilirlik kriterlerini karşılar;

– Solüsyon D (negatif kontrol) için elde edilen sonuç, kullanılan LAL reaktifinin Kullanım Talimatlarında belirtilen değeri aşmaz veya kullanılan yöntemle saptanan endotoksin konsantrasyonundan daha düşüktür.

Eklenen endotoksinin deneysel ortalama konsantrasyonu, ortalama endotoksin konsantrasyonunun çıkarılmasıyla hesaplanır. çözümA(varsa) ortalama endotoksin konsantrasyonundan çözümİÇİNDE(ilave endotoksin içeren).

Test edilen çözeltiye eklenen endotoksinin ölçülen konsantrasyonu, test koşulları altında eklenen endotoksinin bilinen konsantrasyonunun %50 ila %200'ü ise, test edilen çözeltinin hiçbir engelleyici faktör içermediği kabul edilir.

Deneyde endotoksin konsantrasyonu belirlenen limitlerin dışındaysa, test edilen tıbbi ürünün reaksiyona müdahale eden faktörler içerdiği sonucuna varılır. Bu durumda test, MAD'ye eşit dilüsyona kadar daha yüksek bir dilüsyonda tekrarlanabilir. Test edilen tıbbi ürünün daha yüksek dilüsyonlarından ayrı olarak, engelleyici faktörlerin etkileri, filtrasyon, nötralizasyon, diyaliz veya ısıl işlem gibi uygun işlemlerle giderilebilir. Etkileşen faktörleri ortadan kaldırmak için seçilen yöntem, test edilen tıbbi üründeki bakteriyel endotoksinlerin konsantrasyonunu düşürmemelidir, bu nedenle bu tür işlemlerden önce bilinen konsantrasyondaki ERS solüsyonu test edilen solüsyona eklenmeli ve ardından “Enterferans oluşturan faktörler” analizi yapılmalıdır. tekrarlanacak Seçilen işleme türünden sonra elde edilen test sonuçları tatmin edici bulunursa, test edilen tıbbi ürün bakteriyel endotoksinlerin içeriği açısından analiz edilebilir.

test prosedürü

Açıklama Prosedür. Test, "Girişen faktörler" bölümünde yer alan prosedür açıklamasına uygun olarak yapılmalıdır.

sonuçlar . Endotoksin konsantrasyonu, her kopya için belirlenmelidir. çözümA ERS seri dilüsyonları kullanılarak elde edilen standart eğri kullanılarak ( çözümİLE).

Aşağıdaki koşullar yerine getirildiğinde test sonuçları güvenilir kabul edilir:

1. standart eğri için elde edilen sonuçlar ( ÇözümlerİLE) "Standart eğri kriterleri güvenilirlik kontrolü" bölümü için belirlenen güvenilirlik kriterlerini karşılar;
2. eklenen endotoksinin deneysel konsantrasyonu Çözüm B için bulunan endotoksin konsantrasyon değerini çıkardıktan sonra çözümA bilinen değerin %50 ila %200'ü aralığında yer alır;
3. için elde edilen sonuç Çözüm D(negatif kontrol) kullanılan LAL reaktifinin Kullanım Talimatlarında belirtilen değeri aşmaması veya kullanılan yöntemle tespit edilen endotoksin konsantrasyonundan düşük olması.

Sonuçların yorumlanması. Bir tıbbi ürün, test için bulunan bakteriyel endotoksinlerin deneysel ortalama içeriğinin çözümA tekrarlar (test edilen tıbbi ürünün seyreltisi ve konsantrasyonu için ayarlanmış), Farmakope Monografında belirtilen bakteriyel endotoksin içeriği üst sınırından düşüktür.

öne çıkmak çevre Bir mikroorganizmanın yaşamı boyunca. endotoksinler bakteri hücresi ile güçlü bir şekilde ilişkilidir ve hücre ölümünden sonra çevreye salınır.

Endo ve ekzotoksinlerin özellikleri.

Ekzotoksinler, sözde nedensel ajanları oluşturur. toksinemi difteri, tetanoz, gazlı kangren, botulizm, stafilokok ve streptokok enfeksiyonlarının bazı formlarını içeren enfeksiyonlar.

Bazı bakteriler aynı anda hem ekzo- hem de endotoksinler oluşturur (E. coli, Vibrio cholerae).

Ekzotoksin almak.

1) sıvı bir besin ortamında toksijenik (ekzotoksin oluşturan) bir kültür yetiştirmek;

2) bakteri filtrelerinden süzme (ekzotoksinin bakteri hücrelerinden ayrılması); diğer temizleme yöntemleri kullanılabilir.

Ekzotoksinler daha sonra toksoidleri üretmek için kullanılır.

Toksoid elde etmek.

1) Ekzotoksin çözeltisine (toksijenik bakteri et suyu kültürünün süzüntüsü) %0.4 formalin eklenir ve 3-4 hafta 39-40°C'de bir termostatta tutulur; toksisite kaybı vardır, ancak antijenik ve immünojenik özellikler korunur;

2) koruyucu ve adjuvan ekleyin.

3) organizmanın genel fizyolojik reaktivitesi; tanımlandı fizyolojik özellikler makroorganizma, metabolizmanın doğası, iç organların işlevi, endokrin bezleri, bağışıklığın özellikleri.

toplam için fizyolojik reaktivite etkilenir:

A) cinsiyet ve yaş: çocukluk enfeksiyonları vardır (kızıl, boğmaca, kızamık, parotit), pnömoni yaşlılıkta şiddetlidir, hamilelik sırasında kadınlar stafilokok ve streptokok enfeksiyonlarına daha duyarlıdır, 6 aya kadar çocuklar birçok enfeksiyona dirençlidir, tk. anneden antikor almak;

B) sinir sisteminin durumu: sinir sisteminin depresyonu, daha şiddetli bir enfeksiyon seyrine katkıda bulunur; zihinsel bozukluklar merkezi sinir sisteminin düzenleyici işlevini azaltmak;

v) somatik hastalıkların varlığı(diyabet, kardiyovasküler sistem hastalıkları, karaciğer, böbrekler);

G) durum normal mikroflora temsilcileri karşıt özelliklere sahip olan;

e) beslenme: yetersiz ve yetersiz beslenme ile insanlar bulaşıcı hastalıklara (tüberküloz, dizanteri, kolera) karşı daha hassastır, gıdanın protein bileşenleri, vitaminler ve eser elementler, antikorların sentezi ve aktif fagositozun sürdürülmesi için gerekli olduklarından en büyük öneme sahiptir. ; açlık sonucunda sadece bireysel değil, tür bağışıklığı da kaybolabilir; vitamin eksikliği, enfeksiyonlara karşı direnci azaltan metabolik bozukluklara yol açar;

e) immünobiyolojik özellikler organizma, yani doğal koruyucu faktörlerin kararlılığı.

Canlı doğanın krallıklarından biri, Bakteri bölümünde izole edilmiş tek hücreli canlı organizmaları içerir. Türlerinin çoğu özel kimyasal bileşikler üretir - ekzotoksinler ve endotoksinler. Bu yazıda sınıflandırılmaları, özellikleri ve insan vücudu üzerindeki etkileri incelenecektir.

toksinler nelerdir

Ölümünden sonra hücreler arası sıvıya salınan maddeler (esas olarak bir protein veya lipopolisakarit yapısında) bakteriyel endotoksinlerdir. Canlı bir prokaryotik organizma, konakçı hücreye toksik maddeler üretiyorsa, mikrobiyolojide bu tür bileşiklere ekzotoksinler denir. İnsan dokuları ve organları üzerinde yıkıcı bir etkiye sahiptirler, yani: enzimatik aparatı hücresel düzeyde etkisiz hale getirirler, metabolizmayı bozarlar. Endotoksin, canlı hücreler üzerinde zararlı etkisi olan bir zehirdir ve konsantrasyonu çok küçük olabilir. Mikrobiyolojide bakteri hücreleri tarafından salgılanan yaklaşık 60 bileşik bilinmektedir. Onları daha ayrıntılı olarak ele alalım.

Bakteriyel zehirlerin lipopolisakarit doğası

Bilim adamları, endotoksinin, dış zarın bir bölünme ürünü olduğunu bulmuşlardır.Belirli bir hücre reseptörü tipi ile etkileşime giren karmaşık bir karbonhidrat ve lipitten oluşan bir komplekstir. Böyle bir bileşik üç kısımdan oluşur: lipit A, bir oligosakarit molekülü ve bir antijen. Şiddetli zehirlenmenin tüm belirtileriyle birlikte en büyük zarar verici etkiye neden olan kan dolaşımına giren ilk bileşendir: dispeptik semptomlar, hipertermi, merkezi sinir sistemi lezyonları. Kanın endotoksinlerle enfeksiyonu o kadar hızlı gerçekleşir ki vücut gelişir. septik şok.

Endotoksine dahil olan diğer bir yapısal element, heptoz - C7H14O7 içeren bir oligosakkarittir. Kan dolaşımına giren merkezi disakkarit de vücudun zehirlenmesine neden olabilir, ancak lipit A'nın kana girmesinden daha hafif bir formdadır.

Endotoksinlerin insan vücudu üzerindeki etkileri

Bakteriyel zehirlerin hücreler üzerindeki etkisinin en yaygın sonuçları trombohemorajik sendrom ve septik şoktur. İlk patoloji türü, pıhtılaşabilirliğini azaltan toksinler olan maddelerin kanına girmesi nedeniyle oluşur. Bu, aşağıdakilerden oluşan organlarda çok sayıda hasara yol açar: bağ dokusu- örneğin akciğerler, karaciğer, böbrekler gibi parankim. Parankimlerinde çoklu kanamalar ve ciddi vakalarda kanama meydana gelir. Bakteriyel zehirlerin etkisinden kaynaklanan başka bir patoloji türü septik şoktur. Kan ve lenf dolaşımında bozukluklara yol açar, bunun sonucunda oksijen taşınmasında bozukluklar olur ve besinler hayati organlara ve dokulara: beyin, akciğerler, böbrekler, karaciğer.

Kişide hızlı düşme gibi yaşamı tehdit eden semptomlarda keskin bir artış vardır. tansiyon, hipertermi ve hızla gelişen akut kardiyovasküler yetmezlik. Acil tıbbi müdahale (hormonal ve antibiyotik tedavisi) endotoksinin etkisini durdurur ve vücuttan hızla uzaklaştırır.

Ekzotoksinlerin ayırt edici özellikleri

Bu tür bakteriyel zehirlerin özelliklerini açıklamadan önce, endotoksinin ölü bir gram-negatif bakterinin hücre duvarı lizatının bileşenlerinden biri olduğunu hatırlayalım. Ekzotoksinler hem Gram-pozitif hem de Gram-negatif organizmalar tarafından sentezlenir. Kimyasal yapı açısından, bunlar yalnızca küçük moleküler ağırlığa sahip proteinlerdir. Denilebilir ki, esas olan klinik bulgular, bulaşıcı hastalıklar sürecinde ortaya çıkan, tam olarak bakterinin kendisinin metabolizmasının bir sonucu olarak oluşan ekzotoksinlerin zararlı etkisinden kaynaklanır.

Mikrobiyolojik çalışmalar, endotoksinlerden daha yüksek bir bakteriyel zehir türü olduğunu kanıtlamıştır. Tetanoz, boğmaca, difteri etken maddeleri, protein yapısında zehirli maddeler üretir. Termolabiliteye sahiptirler ve 70 ila 95 santigrat derece aralığında 12-25 dakika ısıtıldıklarında yok olurlar.

Ekzotoksin türleri

Bu tür bakteriyel zehirlerin sınıflandırılması, hücre yapıları üzerindeki etkilerinin ilkesine dayanmaktadır. Örneğin, membranotoksinler ayırt edilir, konakçı hücre zarını tahrip ederler veya zar çift tabakasından geçen iyonların difüzyonunu bozarlar. Sitotoksinler de vardır. Bunlar hücrenin hyaloplazmasına etki eden ve hücre metabolizmasında meydana gelen asimilasyon ve disimilasyon reaksiyonlarını bozan zehirlerdir. Diğer bileşikler - zehirler, örneğin hiyalüronidaz (nörominidaz) gibi enzimler gibi "çalışır". İşi bastırıyorlar bağışıklık sistemi insanda, yani insan vücudunda B lenfosit, monosit ve makrofaj üretimini inaktive ederler. Lenf düğümleri. Böylece proteazlar koruyucu antikorları yok eder ve lesitinaz sinir liflerinin bir parçası olan lesitini parçalar. Bu, biyoimpulsların iletiminin ihlaline ve sonuç olarak organ ve dokuların innervasyonunda bir azalmaya yol açar.

Sitotoksinler, konakçı hücre zarının lipit tabakasının bütünlüğünü bozarak deterjan görevi görebilir. Dahası, hem vücudun tek tek hücrelerini hem de ortak dokularını yok edebilirler, metabolik reaksiyonların ürünleri olan ve toksik özellikler sergileyen biyojenik aminlerin oluşumuna neden olurlar.

Bakteri zehirlerinin etki mekanizması

Mikrobiyolojik çalışmalar, endotoksinin 2 moleküler merkez içeren karmaşık bir yapı olduğunu ortaya koymuştur. Birincisi, belirli bir hücre reseptörüne zehirli bir madde bağlar ve ikincisi, zarını bölerek doğrudan hücre hyaloplazmasına girer. İçinde toksin metabolik reaksiyonları bloke eder: ribozomlarda meydana gelen protein biyosentezi, mitokondri tarafından gerçekleştirilen ATP sentezi ve nükleik asit replikasyonu. Moleküllerinin kimyasal yapısı açısından bakteriyel peptitlerin yüksek virülansı, toksinin bazı lokuslarının, nörotransmiterler, hormonlar ve enzimler gibi hücredeki maddelerin uzaysal yapısı olarak maskelenmesi gerçeğiyle açıklanır. Bu, toksinin "hücresel savunma sistemini atlamasına" ve hızla sitoplazmasına nüfuz etmesine izin verir. Böylece hücre, kendi koruyucu maddelerini oluşturma yeteneğini kaybettiği için bakteriyel bir enfeksiyona karşı savunmasızdır: interferon, gama globulinler, antikorlar. Endotoksinlerin ve ekzotoksinlerin özelliklerinin benzer olduğuna dikkat edilmelidir, çünkü her iki bakteri zehiri de vücudun belirli hücrelerini etkiler, yani yüksek özgüllüğe sahiptirler.

Canlı bir bakteri hücresi tarafından salgılanan çözünür bileşikler.

Ansiklopedik YouTube

1 / 3

✪ ROT'tan Özgürlük

✪ Gonore (alkış) 👫😱

✪ Ayurveda. Guggul.

altyazılar

lipopolisakarit

Endotoksinlerin ana örneği lipopolisakarit veya lipooligosakkarittir. Gram-negatif bakteriyel lipopolisakkarit, bir endotoksin olarak o kadar kapsamlı bir şekilde çalışılmış ve o kadar yaygın bir şekilde kullanılmıştır ki, endotoksin ve lipopolisakarit terimleri sıklıkla birbirinin yerine kullanılmaktadır.

endotoksin. endotoksin saldırganlığı

Farklı orijinli endotoksin moleküllerinde bir glikolipidin varlığı, bunların ortaklığını belirler. biyolojik özellikler. Endotoksinin fizyolojik konsantrasyonları çok geniş bir aralıkta dalgalanır (sıfıra yakın ila 1.0 EU/ml) ve yaşla birlikte sabit bir artış eğilimi gösterir. Fizyolojik koşullar altında dolaşımdaki lökositlerin %5-7'si yüzeylerinde LPS taşır. Makrofajlarda ve diğer birçok vücut hücresinde bulunan CD14/TLR4/MD2 reseptör kompleksi LPS'yi bağlar.
Makroorganizma hücreleri ile LPS reaksiyonunun sonucu, konsantrasyonuna bağlıdır. Hücre ve sistemlerin düşük dozlarda endotoksin dozunun artmasıyla ılımlı aktivasyonu hiperaktivasyona dönüşür, buna inflamatuar sitokinlerin üretiminin artması, kompleman sisteminin ve kan pıhtılaşma faktörlerinin aktivasyonunun artması eşlik eder ve bu da bu tür korkunç komplikasyonların gelişmesine neden olabilir. yaygın damar içi pıhtılaşma (DIC), endotoksin şoku ve akut çoklu organ yetmezliği. LPS bağlayıcı faktörlerin göreli yetersizliği koşulları altında sistemik dolaşıma aşırı endotoksin alımı ve ayrıca LPS salgılama sistemlerinin (öncelikle böbrekler) yetersizliği ile endotoksin çok sayıda patojenik özelliğini gösterebilir. Aşırı LPS'nin çeşitli hastalıkların patogenezinde yer almasına “endotoksin saldırganlığı” denir. Endotoksin saldırganlığının gelişmesinin nedenleri çok çeşitlidir: en yaygın olanı stres ve bağırsak bariyerinin geçirgenliğinde bir artışa yol açan herhangi bir patolojik süreçtir (gıda zehirlenmesi ve akut). bağırsak enfeksiyonları, alkol fazlalığı ve dysbacteriosis, alışılmadık derecede yağlı ve baharatlı yiyecekler, akut viral enfeksiyonlar, şok, vb.), portal hipertansiyon ve karaciğer hastalığı, kronik ve akut böbrek yetmezliği(ana LPS salgılayan organ böbrekler olduğu için).
Enterosorpsiyon, kandaki endotoksin seviyesini normalleştirmek için ekonomik ve güvenli bir yöntemdir. Bağırsaktaki enterosorbent endotoksini bağlar ve enterohematik bariyerden girişini azaltır. Enterosorbent aynı anda hasarlı bağırsak bariyerinin restorasyonuna katkıda bulunursa, enterosorpsiyonun etkinliği önemli ölçüde artar.

Diğer endotoksinler

Lipopolisakarit dışındaki endotoksinlere bir örnek, Gram-pozitif Bacillus thuringiensis'in böcek öldürücü delta toksinidir. Bu toksin, spor oluşumu sırasında basil tarafından sentezlenen ve bakteri sporunda kristaller oluşturan bir proteindir. Bu tür sporlara sahip bir bitki böcek larvaları tarafından yenildiğinde, bu proteinin proteolizi, larva bağırsak epitel hücrelerinin zarına dahil olan ve bir katyon kanalı oluşturarak hücre parçalanmasına ve ölümüne neden olan spesifik bir protein ürününün oluşumuna yol açar. Delta toksini, sitotoksisitenin tezahürü için spesifik aktivasyon gerektirdiğinden insanlar için zararsızdır.

Kimyasal yapıları gereği bakteriler tarafından sentezlenen toksik maddeler proteinlere (ekzotoksinler) ve LPS'ye (endotoksinler) aittir - bunlar B duvarında lokalizedir!! ve ancak imha edildikten sonra serbest bırakılır.

endotoksinler. Bunlar, Gram negatif bakterilerin hücre duvarında bulunan lipopolisakkaritleri (LPS) içerir. Toksik özellikler belirlenir tüm LPS molekülü , ve tek tek parçaları değil: PS veya lipid A. Enterobakterilerin (escherichia, shigella ve salmonella, brusella, tularemi bakterileri) endotoksinleri iyi çalışılmıştır.

LPS (endotoksinler), ekzotoksinlerin aksine, yüksek t°C'ye karşı daha dirençli, daha az toksik ve daha az spesifiktir. Ò ile tanıtıldığında, deneysel F!! hangi gr-B'den bağımsız olarak yaklaşık olarak aynı reaksiyona neden olur!! vurgulanırlar. BÜYÜK DOZLAR UYGULANIRKEN, fagositozun inhibisyonu, toksikoz, halsizlik, nefes darlığı, bağırsak rahatsızlığı (ishal), aktivitede azalma ve vücudun ↓ t ° C'si gözlenir. KÜÇÜK DOZLARIN tanıtılmasıyla - zıt etki: fagositozun uyarılması, vücudun t ° C'si.

İNSANLARDA, endotoksinlerin kan dolaşımına girmesi, ateş endojen pirojenlerin salındığı kan hücreleri (granülositler, monositler) üzerindeki etkilerinin bir sonucu olarak. erken doğar lökopeni, ikincil ile değiştirilir lökositoz. Artan glikoliz Þ Hipoglisemi meydana gelebilir. Ayrıca gelişen hipotansiyon(kana giren serotonin ve kinin miktarı) bozulur Kan temini organlar ve asidoz.

LPS, komplemanın C3 fraksiyonunu, serumdaki içeriğinin ALTERNATİF YOLU Þ ↓ ve biyolojik olarak aktif fraksiyonların (C3a, C3b, C5a, vb.) birikimi boyunca aktive eder. Kan dolaşımına giren büyük miktarlarda endotoksin ZEHİRLİ-SEPTİK ŞOK'a yol açar.

LPS nispeten zayıf bir immünojendir. Saf endotoksin ile aşılanmış hayvanların kan serumu, yüksek bir antitoksik aktiviteye sahip değildir ve toksik özelliklerini tamamen nötralize edemez.

Bazı bakteriler aynı anda hem protein toksinleri hem de endotoksinler oluşturur, örneğin Escherichia coli, vb.

8. Patojenitenin genetik yönleri.? (Yanlış cevap)

BAKTERİ ANTİJENLERİ

Her mikron birkaç AG içerir. Yapısı ne kadar karmaşıksa, o kadar çok AG. Mikron cinsinden, GRUBUNA ÖZGÜ AG'ler (aynı cins veya familyanın farklı türlerinde bulunur), TÜRE ÖZGÜ (aynı türün farklı temsilcilerinde) ve TİPE ÖZGÜ (VARIANT) AG'ler (aynı tür içindeki farklı varyantlarda) ayırt edilir. → serovarlar). Bakteriyel antijenler arasında H, O, K vb.

Kamçılı N-AG- protein flagellin, ısıtılarak yok edilir, ancak fenol ile muameleden sonra antijenik özelliklerini korur.

Somatik O-AG– LPS # duvar gr–. Belirleyici gruplar, ana gövdeye bağlı PS zincirlerinin terminal tekrar eden birimleridir. Belirleyici gruplardaki şekerlerin bileşimleri ve sayıları farklı bakterilerde aynı değildir. Çoğu zaman heksozlar ve amino şekerler içerirler. O-AG termal olarak kararlıdır, 1-2 saat kaynamaya devam eder ve formalin ve etanol ile işlendikten sonra yok olmaz.

K-AG (kapsül) - Escherichia ve Salmonella'da iyi çalışılmıştır. O-AG gibi, LPS # duvarları ve kapsülü ile ilişkilidirler, ancak O-AG'den farklı olarak, esas olarak asidik PS (üronik asitler) içerirler. Sıcaklığa duyarlılık ile K-AG ayrılır A-(2 saatten fazla kaynamaya dayanıklıdır), İÇİNDE-(60°C'ye kadar kısa ısıtma) ve L-AG(termolabil). C-AG daha yüzeysel olarak yerleşir Þ O-AG'yi saptamak için önce kültürlerin kaynatılmasıyla elde edilen kapsülü yok etmek gerekir.

Kapsüler antijenler denir Vi-AG(tifo ve yüksek virülanslı diğer bazı enterobakterilerde bulunur).

PS capsular AG (genellikle tipe özgü), pnömokoklarda, Klebsiella'da ve belirgin bir kapsül oluşturan diğer bakterilerde bulunur. Şarbon basilinde K-AG, polipeptitlerden oluşur.

Toksinler (çözünür proteinler iseler) ve enzimler- tam teşekküllü AH'ye sahip olmak.

VİRÜS AG. AG basit viryonlar, nükleokapsidleri ile ilişkilidir, kimyasal bileşimde ribonükleoproteinler veya deoksiribonükleoproteinlerdir. Çözünürdürler ve S-antijenleri (çözüntü - çözelti) olarak adlandırılırlar. -de zor Virüslerde, bazı antijenler nükleokapsid ile ilişkiliyken, diğerleri süperkapsid zarfın glikoproteinleri ile ilişkilidir. Birçok virion, özel yüzey V-AG'leri - hemaglutinin (GA veya hemadsorpsiyon reaksiyonunda, RTGA'da tespit edilir) ve nöraminidaz enzimi içerir.

Viral antijenler olabilir gruba özgü veya türe özgü, bu farklılıklar virüsleri tanımlarken dikkate alınır.

Heterojen AG (heteroantijenler) temsilcilerde bulunan yaygın hipertansiyon Çeşitli türler mikroorganizmalar, hayvanlar ve bitkiler.

AG Ò CHKA VE F!!

Protein AG F!! XX, türlerin özgüllüğünü ifade etti, buna dayanarak, çeşitli hayvan ve bitki türlerinin ilişkisi yargılanabilir. Protein AG dokuları ve ## F!! ayrıca organ ve doku özgüllüğüne sahiptirler → hücre farklılaşması ve tümör büyümesi çalışması.

tümör antijenleri. Normal ##'nin tümör hücrelerine habis dönüşümünün bir sonucu olarak, normal ##'de olmayan spesifik AH'ler içlerinde görünmeye başlar. Spesifik tümör T-AG'leri (tümör - tümör) tespit edilir → çeşitli insan tümörlerinin erken teşhisi için immünolojik yöntemler.

otoantijenler. Normalde AG özelliklerini göstermeyen kendi AG T'leri, belirli koşullar altında autoAG adı verilen antikorların (otoantikorlar) oluşumuna neden olur. Embriyonik dönemde, vücudun autoAG'ye karşı doğal bir immünolojik toleransı oluşur ve bu genellikle yaşam boyunca devam eder. Doğal tolerans kaybı → otoimmün hastalıklar.

İzoantijenler. Bunlar, aynı türden bireysel bireylerin veya birey gruplarının birbirinden farklı olduğu antijenlerdir: ABO sistemi, Rhesus, vb.

9. Antijen.

Antijenler ikiye ayrılır tam (immünojenik) her zaman immünojenik ve antijenik özellikler sergileyen ve eksik (haptens) kendi başlarına bir bağışıklık tepkisi oluşturamazlar.

Haptenler, özgüllüklerini, antikorlar veya lenfosit reseptörleri ile seçici olarak etkileşime girme ve immünolojik reaksiyonlarla belirlenme yeteneklerini belirleyen antijeniteye sahiptir. Haptenler, bir immünojenik taşıyıcıya (örneğin, protein) bağlandığında immünojenik hale gelebilir, yani. dolu olmak

Hapten kısmı, antijenin özgüllüğünden sorumludur ve taşıyıcı (daha sıklıkla protein) immünojenisiteden sorumludur.

immünojenisite bir dizi nedene bağlıdır (molekül ağırlığı, antijen moleküllerinin hareketliliği, şekli, yapısı, değişebilme yeteneği). Derece önemlidir antijenin heterojenliği, yani yabancılık belirli bir tür (makroorganizma) için, moleküllerin evrimsel ayrışma derecesi, yapının benzersizliği ve olağandışılığı. Yabancılık da tanımlanır biyopolimerin moleküler ağırlığı, boyutu ve yapısı, makromoleküler ve yapısal sertliği. Daha yüksek moleküler ağırlığa sahip proteinler ve diğer makromoleküler maddeler en immünojeniktir. Amino asit dizilerinin bileşiminde aromatik halkaların varlığı ile ilişkili olan yapının sertliği büyük önem taşımaktadır. Polipeptit zincirlerindeki amino asit dizisi, genetik olarak belirlenmiş bir özelliktir.

Proteinlerin antijenitesi, yabancı olmalarının bir tezahürüdür ve özgüllüğü, proteinlerin amino asit dizisine, ikincil, üçüncül ve dörtlü (yani, protein molekülünün genel konformasyonuna) yapısına, yüzeysel olarak yerleştirilmiş determinant gruplara ve terminal aminoya bağlıdır. asit kalıntıları. Koloidal durum ve çözünürlük - antijenlerin temel özellikleri.

Antijenlerin özgüllüğü, protein ve polisakkarit moleküllerinin belirli bölgelerine bağlıdır. epitoplar. Epitoplar veya antijenik belirleyiciler - Bir bağışıklık tepkisine neden olan ve özgüllüğünü belirleyen antijen moleküllerinin fragmanları. Antijenik belirleyiciler, seçici olarak antikorlar veya antijen tanıyan hücre reseptörleri ile reaksiyona girer.

Birçok antijenik determinantın yapısı bilinmektedir. Proteinlerde, bunlar genellikle yüzeyde çıkıntı yapan 8-20 amino asit kalıntısının fragmanlarıdır, polisakkaritlerde, LPS'nin bileşimindeki çıkıntılı O-tarafı deoksisakarit zincirlerinde, influenza virüsünde, hemaglutinin ve insan immün yetmezlik virüsünde, membran glikopeptididir.

Epitoplar niteliksel olarak farklılık gösterebilir ve her biri için "kendi" antikorları oluşturulabilir. Tek bir antijenik determinant içeren antijenlere denir. tek değerli birkaç epitop çok değerli polimer antijenlerçok sayıda özdeş epitop içerir (flagellinler, LPS).

Ana antijenik özgüllük türleri(epitopların özgüllüğüne bağlı olarak).

1.Türler- aynı türün tüm bireyleri için karakteristik (ortak epitoplar).

2.grup- tür içinde (bireysel grupların karakteristiği olan izoantijenler). Bir örnek, kan gruplarıdır (ABO, vb.).

3.heterospesifiklik- farklı taksonomik grupların organizmalarında ortak antijenik determinantların varlığı. Bakterilerde ve konakçı dokularda çapraz reaktif antijenler vardır.

A. Forsman antijeni, kedilerin, köpeklerin, koyunların ve kobay böbreklerinin eritrositlerinde bulunan tipik bir çapraz reaktif antijendir.

b.Rh- eritrosit sistemi. İnsanlarda Rh antijenleri, antikorları Macacus rhesus eritrositlerine aglütine eder, örn. çapraz.

V. İnsan eritrositlerinin ve veba basili, çiçek hastalığı ve grip virüslerinin ortak antijenik belirleyicileri bilinmektedir.

d. Başka bir örnek, streptokok ve miyokard dokusunun (kapak aparatı) protein A'sıdır.

Bu tür antijenik taklit, bağışıklık sistemini aldatır ve mikroorganizmaları onun etkilerinden korur. Çapraz antijenlerin varlığı, yabancı yapıları tanıyan sistemleri bloke edebilir.

4.patolojik. Dokulardaki çeşitli patolojik değişikliklerle, normal antijenik özgüllüğü değiştirebilen kimyasal bileşiklerde değişiklikler meydana gelir. Tür özgüllüğü değiştirilmiş “yanık”, “radyasyon”, “kanser” antijenleri ortaya çıkar. bir konsept var otoantijenler Vücutta bağışıklık reaksiyonlarının meydana gelebileceği maddeler (sözde otoimmün reaksiyonlar) belirli vücut dokularına yöneliktir. Çoğu zaman bu, bariyerlerin (beyin, lens, paratiroid bezleri vb.) varlığı nedeniyle normalde bağışıklık sisteminden etkilenmeyen organ ve dokuları ifade eder.

5.Stadiospesifiklik. Morfojenez ile ilişkili belirli gelişim aşamalarının karakteristiği olan antijenler vardır. Alfa-fetoprotein, embriyonik gelişimin karakteristiğidir; erişkin durumda sentez, karaciğer kanserinde keskin bir şekilde artar.

AG– alıcının bağışıklık sistemi Ò tarafından genetik olarak yabancı ## olarak tanınan ve çeşitli bağışıklık tepkisi biçimlerine neden olan herhangi bir menşeli maddeler. Her AG'nin 4 ÖZELLİĞİ vardır: antijenite, immünojenisite, özgüllük ve yabancılık.

İMMÜNOJENİTE– AG'nin T alıcısında bir bağışıklık tepkisini indükleme yeteneği (antikor oluşumu, aşırı duyarlılık oluşumu, immünolojik hafıza ve tolerans).

ANTİJENİTE- AG'nin bağışıklık reaksiyonlarının ürünleriyle (örneğin, AT ile) etkileşime girme yeteneği.

Kimyasal doğa. AG - yüksek Mg içeren doğal veya sentetik biyopolimerler (proteinler ve polipeptitler, PS (Mg'leri en az 600.000 ise), NA ve lipitler. Denatürasyon (ısıtma, güçlü asitler veya alkalilerle işleme) sırasında proteinler AG özelliklerini kaybeder. antijenik etki AG'nin katabolik yıkımı ile ilişkilidir Örneğin, L-AA'dan gelen polipeptitler antijeniktir, ancak D-AA'dan değildir, çünkü vücudun enzimleri tarafından nispeten yavaş ve tamamen yok edilmezler.

Yabancılık (heterojenlik)– en çok başka bir türün proteinleri ile bağışıklama sırasında belirgindir. Bir istisna, özel işlevlere (enzimler, hormonlar, hemoglobin) sahip proteinlerdir, ancak yapılarında kısmi bir değişiklikle antijenite kazanabilirler.

Antijenite ayrıca şunlara da bağlıdır: aşılanmış hayvanın türü, veriliş yolu, doz, imha oranıÒ alıcısında AG. Bazı antijenlerin antijenik özellikleri, oral olarak, diğerleri - intradermal ve diğerleri - intramüsküler olarak uygulandıklarında daha iyi kendini gösterir.

ile antijenlerin uygulanması üzerine antijenite adjuvanlar(alüminyum hidroksit veya fosfat, yağ emülsiyonu, gram negatif bakterilerin LPS'si). Adjuvanların etki mekanizması - bir AG deposu oluşturulur, fagositozu uyarır, lenfositler üzerinde mitojenik etki.

ÖZGÜLLÜK- antijenlerin yüzey yapısının özellikleri, - epitopların varlığı, - taşıyıcı makromolekülün yüzeyindeki belirleyici grupların varlığı ile belirlenir. Epitoplar, protein yüzeyindeki çeşitli AA kombinasyonları nedeniyle çok çeşitlidir; birkaç AA, bir epitop oluşturur. AG'nin yüzeyinde, genellikle AG'nin POLİVALANSINI belirleyen birkaç epitop vardır, eğer 1 epitop TEK DEĞERLİ ise, birkaç özdeş epitop varsa, bu POLİMERİK'tir. Bir epitop taşıyıcı molekülden ayrıldığında antijen özelliklerini kaybeder, ancak homolog antikorlarla reaksiyona girebilir. Epitopu değiştirerek AG'nin özgüllüğünü yapay olarak değiştirmek mümkündür.

FULL AG'ler bu özelliklerin tümüne sahiptir. Eksik AG'ler (HAPTENS) immünojenik değildir, ancak taşıyıcı proteinlerle kombinasyon halinde tam hale gelirler.

10. Antikorlar.

antikorlar- vücutta antijenik stimülasyona yanıt olarak oluşan ve antijenle spesifik olarak etkileşime girebilen (in vivo, in vitro) gama-globülin doğasına sahip spesifik proteinler. Uluslararası sınıflandırmaya göre, antikorların özelliklerine sahip serum proteinlerinin toplamına denir. immünoglobulinler.

Antikorların benzersizliği, yalnızca oluşumlarına neden olan antijenle spesifik olarak etkileşime girebilmelerinde yatmaktadır.

İmmünoglobulinler (Ig), lokalizasyona bağlı olarak üç gruba ayrılır:

serum (kanda);

Secretory (sırlar-içeriklerde gastrointestinal kanal, lakrimal sekresyon, tükürük, özellikle anne sütü) sağlamak yerel bağışıklık(mukozal bağışıklık);

Yüzeysel (immünokompetan hücrelerin yüzeyinde, özellikle B-lenfositlerde).

Herhangi bir antikor molekülü benzer bir yapıya (Y-şekli) sahiptir ve disülfit köprüleriyle birbirine bağlanan iki ağır (H) ve iki hafif (L) zincirden oluşur. Her bir antikor molekülü, antikor özgüllüğünü belirleyen iki özdeş antijen bağlama fragmanına (Fragman antijen bağlanması) ve antijeni bağlamayan ancak efektör biyolojik fonksiyonlara sahip olan bir Fc (fragment sabiti) fragmanına sahiptir. Membrandaki "kendi" reseptörü ile etkileşime girer. çeşitli tipler hücreler (makrofaj, mast hücresi, nötrofil).

İmmünoglobulin molekülünün hafif ve ağır zincirlerinin terminal bölümleri, bileşim (amino asit dizileri) açısından değişkendir ve VL ve VH bölgeleri olarak adlandırılır. Hiperdeğişken bölgeler, yapıyı belirleyen bileşimlerinde ayırt edilir antikorların aktif bölgesi (antijen bağlama merkezi veya paratop). Antijenin antijenik determinantı (epitop) onunla etkileşime girer. Antikorların antijen bağlama merkezi, "anahtar kilidi" ilkesine göre antijen epitopunu tamamlayıcıdır ve L- ve H-zincirlerinin hiperdeğişken bölgelerinden oluşur. Antikor, yalnızca antijenin determinant grubu, antikorun aktif merkezinin boşluğuna tamamen oturduğunda antijen tarafından bağlanacaktır (anahtar kilide düşecektir).

Hafif ve ağır zincirler ayrı bloklardan oluşur - etki alanları. Hafif (L) zincirlerde - iki alan - bir değişken (V) ve bir sabit (C), ağır (H) zincirlerde - bir V ve 3 veya 4 (immünoglobulin sınıfına bağlı olarak) C alanı.

İki tür hafif zincir vardır - kappa ve lambda, çeşitli (tüm) immünoglobulin sınıflarında çeşitli oranlarda bulunurlar.

Açıklığa kavuşmuş beş ağır zincir sınıfı alfa (iki alt sınıfla), gama (dört alt sınıfla), excilon, mu ve delta. Ağır zincirin tanımına göre, immünoglobulin moleküllerinin sınıfı da belirlenir - A, G, E, M ve D.

Her sınıftaki immünoglobulinlerin spesifik özelliklerini nihai olarak belirleyen, farklı immünoglobulin sınıfları için amino asit bileşiminde farklılık gösteren ağır zincirlerin sabit bölgeleridir.

Ağır zincirlerin yapısında farklılık gösteren beş immünoglobülin sınıfı bilinmektedir. moleküler ağırlık, fiziko-kimyasal ve biyolojik özellikler: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD. IgG'nin bir parçası olarak, IgA'nın bir parçası olarak 4 alt sınıf (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) ayırt edilir, iki alt sınıf (IgA1, IgA2).

Antikorların yapısal birimi monomer iki hafif ve iki ağır zincirden oluşur. Monomerler IgG, IgA (serum), IgD ve IgE'dir. IgM- pentamer(polimerik Ig). Polimerik immünoglobulinler, bireysel alt birimleri (IgM pentamer, salgılayıcı IgA di- ve trimerin bir parçası olarak) birleştiren (polimerize eden) ek bir j (eklem) polipeptit zincirine sahiptir.

Antikorların temel biyolojik özellikleri.

1. özgüllük- belirli bir (kendi) antijenle etkileşime girme yeteneği (antijenin epitopunun yazışması ve aktif antikor merkezi).

2 . değerlik- antijenle reaksiyona girebilen aktif merkezlerin sayısı (bunun nedeni moleküler organizasyon - mono- veya polimer). İmmünoglobulinler olabilir iki değerli(IgG) veya çok değerli(IgM pentamerinin 10 aktif bölgesi vardır). İki veya daha fazla değerlikli antikor tam antikorlar. Eksik antikorlar antijenle etkileşimde yer alan yalnızca bir aktif merkeze sahiptir (örneğin aglütinasyon testleri gibi immünolojik reaksiyonlar üzerinde bloke edici etki). Kompleman fiksasyonunun inhibisyonunun reaksiyonu olan antiglobulin Coombs testinde tespit edilirler.

3. yakınlık - antijen epitopu ile aktif antikor bölgesi arasındaki bağın gücü, bunların uzamsal yazışmalarına bağlıdır.

4. Hırs - tüm aktif antikor merkezlerinin epitoplarla etkileşimini hesaba katarak, antijen ve antikorlar arasındaki bağlantının gücünün ayrılmaz bir özelliği. Antijenler genellikle polivalan olduğundan, tek tek antijen molekülleri arasındaki iletişim birkaç antikorun yardımıyla gerçekleştirilir.

5. heterojenlik -şartlandırılmış antijenik özellikler antikorlar, üç tip antijenik determinantın varlığı:

- izotipik- antikorların belirli bir immünoglobulin sınıfına ait olması;

- allotipik- Ig geninin karşılık gelen alelleri tarafından kodlanan immünoglobülinlerdeki alelik farklılıklar nedeniyle;

- aptal- antikor moleküllerinin aktif merkezlerinin özellikleri tarafından belirlenen immünoglobülinin bireysel özelliklerini yansıtır. Belirli bir antijene karşı antikorlar aynı sınıfa, alt sınıfa ve hatta allotipe ait olsalar bile, birbirlerinden spesifik farklılıklar ile karakterize edilirler ( aptalca). H- ve L-zincirlerinin V-bölümlerinin yapısal özelliklerine, amino asit dizilerinin birçok farklı varyantına bağlıdır.

Poliklonal ve monoklonal antikor kavramı ilerleyen bölümlerde verilecektir.

Ana immünoglobulin sınıflarının özellikleri.

IgG. Monomerler dört alt sınıf içerir. Kandaki konsantrasyon 8 ila 17 g / l'dir, yarı ömür yaklaşık 3-4 haftadır. Bu, vücudu bakterilerden, toksinlerden ve virüslerden koruyan ana immünoglobulin sınıfıdır. İÇİNDE en IgG antikorları, ikincil bir bağışıklık tepkisi ile bulaşıcı bir hastalıktan (geç veya 7S antikorları) sonra iyileşme aşamasında üretilir. IgG1 ve IgG4 spesifik olarak (Fab fragmanları aracılığıyla) patojenleri bağlar ( opsonizasyon), Fc fragmanları sayesinde IgG, fagositlerin Fc reseptörleri ile etkileşime girerek mikroorganizmaların fagositozunu ve parçalanmasını teşvik eder. IgG, bakteriyel ekzotoksinleri nötralize edebilir ve tamamlayıcıyı bağlayabilir. Sadece IgG, plasenta yoluyla anneden fetüse taşınabilir (plasenta bariyerini geçebilir) ve fetüs ve yenidoğana maternal antikor koruması sağlayabilir. IgM antikorlarının aksine, IgG antikorları geç kategoriye aittir - daha sonra ortaya çıkarlar ve kanda daha uzun süre tespit edilirler.

IgM. Bu immünoglobülinin molekülü, disülfit bağları ve ek bir J-zinciri ile bağlanan beş alt birimden oluşan bir polimerik Ig olup, 10 antijen bağlama merkezine sahiptir. Filogenetik olarak en eski immünoglobülindir. IgM, bir antijen vücuda ilk girdiğinde oluşan en eski antikor sınıfıdır. Karşılık gelen patojene karşı IgM antikorlarının varlığı, yeni bir enfeksiyonu (mevcut enfeksiyöz süreç) gösterir. Gram-negatif bakterilerin antijenlerine, flagellar antijenlere - esas olarak IgM-antikorlarına karşı antikorlar. IgM, yenidoğanlarda ve bebeklerde sentezlenen ana immünoglobulin sınıfıdır. Yenidoğanlarda IgM, maternal IgM plasentadan geçmediği için intrauterin enfeksiyonun (kızamıkçık, CMV, toksoplazmoz ve diğer intrauterin enfeksiyonlar) bir göstergesidir. Kandaki IgM konsantrasyonu IgG'den düşüktür - 0.5-2.0 g / l, yarı ömür yaklaşık bir haftadır. IgM, bakterileri aglütine edebilir, virüsleri nötralize edebilir, komplemanı aktive edebilir, fagositozu aktive edebilir ve Gram-negatif bakterilerin endotoksinlerini bağlayabilir. IgM, IgG'den daha fazla aviditeye sahiptir (10 aktif merkez), afinite (antijen için afinite) IgG'den daha düşüktür.

IgA. Serum IgA (monomer) ve salgı IgA (IgAs) izole edilir. Serum IgA'sı 1,4-4,2 g/l'dir. Salgı IgA'ları tükürükte, sindirim sıvılarında, burun salgılarında ve kolostrumda bulunur. Yerel bağışıklıklarını sağlayan mukoza zarlarının ilk savunma hattını oluştururlar. IgA'lar bir Ig monomeri, bir J zinciri ve bir glikoproteinden (salgı bileşeni) oluşur. Ekstravasküler sırlarda iki izotip vardır - IgA1 serumda, IgA2 alt sınıfında hakimdir.

Salgı bileşeni, mukoza zarlarının epitel hücreleri tarafından üretilir ve IgA molekülünün epitel hücrelerinden geçtiği sırada ona bağlanır. Salgı bileşeni, IgA moleküllerinin proteolitik enzimlerin etkisine karşı direncini arttırır. IgA'nın ana rolü, lokal mukozal bağışıklığı sağlamaktır. Bakterilerin mukoz membranlara tutunmasını engeller, IgA ile polimerik immün komplekslerin taşınmasını sağlar, enterotoksini nötralize eder, fagositozu ve kompleman sistemi aktive eder.

IgE. Bir monomeri temsil eder, kan serumunda düşük konsantrasyonlarda bulunur. Ana rol - Fc fragmanları ile - mast hücrelerine (mastositler) ve bazofillere bağlanır ve aracılık eder ani aşırı duyarlılık reaksiyonları. IgE, "alerji antikorları" anlamına gelir - yeniden başlar. Alerjik durumlarda, helmintiyazlarda IgE seviyesi yükselir. IgE molekülünün antijen bağlayıcı Fab parçaları, spesifik olarak antijen (alerjen) ile etkileşime girer, oluşan bağışıklık kompleksi, bazofil hücre zarına gömülü IgE'nin Fc parçaları için reseptörlerle etkileşime girer veya mast hücresi. Bu, histamin, diğer biyolojik olarak aktif maddelerin salınması ve akut alerjik reaksiyon gelişimi için bir sinyaldir.

IgD. IgD monomerleri, gelişmekte olan B lenfositlerinin yüzeyinde bulunur ve serumda son derece düşük konsantrasyonlarda bulunur. Biyolojik rolleri kesin olarak belirlenmemiştir. IgD'lerin B hücrelerinin farklılaşmasında yer aldığına, bir anti-idiotipik yanıtın gelişimine katkıda bulunduğuna ve otoimmün süreçlere katıldığına inanılmaktadır.

Bireysel sınıfların immünoglobulin konsantrasyonlarını belirlemek için, daha sıklıkla kullandıkları birkaç yöntem kullanılır. jelde radyal immünodifüzyon yöntemi (Mancini'ye göre) - bir tür çökeltme reaksiyonu ve ELISA.

Tanı için farklı sınıflardaki antikorların belirlenmesi önemlidir. bulaşıcı hastalıklar. Kan serumlarında mikroorganizmaların antijenlerine karşı oluşan antikorların saptanması tanı koymada önemli bir kriterdir. serolojik tanı yöntemi. IgM sınıfı antikorlar hastalığın akut döneminde ortaya çıkar ve nispeten hızlı bir şekilde kaybolur, IgG sınıfı antikorlar daha sonraki bir tarihte tespit edilir ve hasta olanların kan serumunda daha uzun süre (bazen yıllar) kalır, bu durumda anamnestik antikorlar olarak adlandırılırlar.

Kavramları tanımlayın: antikor titresi, teşhis titresi, eşleştirilmiş serum testleri. En önemlisi, IgM antikorlarının saptanması ve antikor titrelerinde (veya serokonversiyon- çalışma sırasında ilk kan serumu ile negatif sonuçlarla ikinci numunede antikorlar tespit edilir) eşleştirilmiş- bulaşıcı sürecin dinamiklerinde birkaç gün-haftalık bir numune aralığında alınır.

Antikorların patojenler ve antijenleri ile etkileşiminin reaksiyonları ( antijen-antikor reaksiyonu kendini bir dizi fenomen şeklinde gösterir - aglütinasyon, çökelme, nötralizasyon, lizis, kompleman fiksasyonu, opsonizasyon, sitotoksisite ve çeşitli bulunabilir serolojik reaksiyonlar.

Antikor üretiminin dinamikleri. Birincil ve ikincil bağışıklık tepkisi.

Birincil yanıt - patojen (antijen) ile birincil temas üzerine, ikincil - tekrarlanan temas üzerine. Ana farklar:

Gizli dönemin süresi (daha fazla - birincil ile);

Antikorların yükselme hızı (daha hızlı - ikincil ile);

Sentezlenen antikorların sayısı (daha fazla - tekrarlanan temasla);

Çeşitli sınıflardaki antikorların sentez dizisi (birincilde IgM daha uzun süre baskındır, ikincilde IgG antikorları hızla sentezlenir ve baskındır).

İkincil bağışıklık tepkisi, oluşumundan kaynaklanmaktadır. bağışıklık hafıza hücreleri.İkincil bir bağışıklık tepkisine bir örnek, aşılamadan sonra bir patojenle karşılaşmadır.

Antikorların bağışıklık oluşumundaki rolü.

Antikorlar oluşumunda önemlidir enfeksiyon sonrası ve aşılama sonrası bağışıklık kazandı.

1. Toksinlere bağlanarak, antikorlar onları nötralize ederek antitoksik bağışıklık.

2. Antikorlar, virüs reseptörlerini bloke ederek virüslerin hücreler üzerinde adsorpsiyonunu önler ve antiviral bağışıklığa katılır.

3. Antijen-antikor kompleksi, efektör fonksiyonları (bakteriyel lizis, opsonizasyon, inflamasyon, makrofaj stimülasyonu) ile klasik kompleman aktivasyon yolunu tetikler.

4. Antikorlar, bakterilerin opsonizasyonunda yer alarak daha verimli fagositoza katkıda bulunur.

5. Antikorlar, dolaşımdaki bağışıklık kompleksleri şeklinde vücuttan (idrar, safra ile) çözünür antijenlerin atılmasına katkıda bulunur.

IgG antitoksik bağışıklıkta en büyük rolü, IgM- antimikrobiyal bağışıklıkta (korpüsküler antijenlerin fagositozu), özellikle Gram-negatif bakterilere karşı, IgA- antiviral bağışıklıkta (virüslerin nötralizasyonu), IgAs- lokal mukozal bağışıklıkta, IgE- hemen tipi aşırı duyarlılık reaksiyonları.

Ig (AT) - kimyasal bileşime göre kan plazma proteinleri - elektroforetik hareketliliğe göre glikoproteinler - γ-globulinler.

YAPI Ig

Ig molekülünün protein kısmı 4 polipeptit zincirinden oluşur: 2 özdeş ağır H zincirleri ve 2 akciğer L zincirleri(Mg cinsinden farklılık gösterir). Her zincir bir değişkenden oluşur V-(N-terminalinden başlar, yaklaşık 110AK = 1 ihtisas) ve kararlı C-parçaları (4-5 alan). Her bir hafif ve ağır zincir çifti birbirine bağlıdır. S-S Köprüler, C-bölgeleri arasında, her iki ağır zincir de sabit yerleri arasında birbirine bağlıdır → menteşe. Her alan içinde, polipeptit zinciri ilmekler halinde katlanır. Hafif ve ağır zincirlerin V bölgelerindeki ilmekler aşırı değişken bölge, antijen bağlama merkezinin bir parçası olan.

IgG, bir proteolitik enzim tarafından hidrolize edildiğinde papain, hafif ve ağır zincirler 3 parçaya ayrılır: iki Fab-(Parça antijen bağlanması) ve bir Fc parçası(Kristal parça). Her bir Fab parçasının serbest N-terminalleri, antijen bağlama (aktif) merkezini oluşturan V alanlarının bir parçasıdır. Fc fragmanı, farklı antikorlar için aynı olan serbest C-terminallerine sahiptir; bunların işlevleri, immünoglobulin G'nin ## membranların Fc reseptörlerine bağlanmasından sonra klasik yol boyunca tamamlayıcı sistemin fiksasyonu ve müteakip aktivasyonudur ve IgG'nin plasentadan geçişi. bölgeler ( epitoplar), belirli bir immünoglobulinin bireysel, tür, grup, antijenik özgüllüğünü belirleyen.

Ig SINIFLARI VE TİPLERİ:

hafif ve ağır zincirlerinin yapısına, özelliklerine ve antijenik özelliklerine bağlıdır.

Ig moleküllerindeki hafif zincirler, kimyasal bileşimde farklılık gösteren iki İZOTİP - lambda (λ) ve kappa (κ) ile temsil edilir. Ig ağır zincirleri, sırasıyla G, M, A, D, E olmak üzere 5 sınıftan birine ait olduklarını belirleyen 5 izotipe (γ, μ, α, δ, ε) bölünmüştür. Fiziksel ve kimyasal özellikleri ile biol özellikleri bakımından birbirlerinden farklılık gösterirler.

Ig'nin izotipik varyantlarının yanı sıra, AG'nin bireysel genetik belirteçlerini taşıyan allotipik (ALLOTYPES) ​​vardır. Her plazma hücresi, bir allotipte bir antikor üretir.

AG özelliklerindeki farklılıklara göre Ig, İDİYOTİPLER'e ayrılır. Farklı Ig'nin V alanları, AG özellikleri (idiotipler) ile de ayırt edilebilir. Aktif merkezlerinin yapısında vücuda yeni antijenik epitoplar (idiotipler) taşıyan herhangi bir antikorun birikmesi, anti-idiotipler adı verilen anti-anti-abs oluşumu ile bunlara karşı bir bağışıklık tepkisinin indüklenmesine yol açar.

ÖZELLİKLER

Farklı sınıflardaki Ig molekülleri aynı yapıdan yapılır. monomerler iki ağır ve iki hafif zincire sahip. Monomerler arasında immünoglobulinler G ve E, pentamerler - IgM bulunur ve IgA, monomerler, dimerler ve tetramerler olarak sunulabilir. Monomerler bir j-zinciri (birleştirme) ile birbirine bağlanır. Farklı Ig sınıfları, özellikle homolog antijenleri bağlama yetenekleri olmak üzere, biyol özellikleri bakımından birbirinden farklıdır. IgG ve IgE monomerlerinin reaksiyonunda 2 antijen bağlama bölgesi yer alır ve çöken bir ağ yapısı oluşur. Ayrıca, 2 merkezden yalnızca birinin bir ağ yapısı oluşturmadan işlev gördüğü monovalan antikorlar da vardır. Bu tür antikorlara eksik denir, Coombs reaksiyonu kullanılarak kan serumunda tespit edilirler.

İmmünoglobulinler farklı özelliklere sahiptir. hırs(AG molekülüne bağlanma hızı ve gücü). Avidite, farklı miktarlarda monomer içeren Ig sınıfına bağlıdır. IgM en yüksek aviditeye sahiptir. AT aviditesi, IgM sentezinden baskın IgG sentezine geçiş nedeniyle bağışıklık tepkisi sırasında değişir.

Farklı Ig sınıfları, plasentadan geçme, tamamlayıcıyı bağlama ve etkinleştirme vb. yeteneklerinde farklılık gösterir. Bu özelliklerden ayrı alanlar sorumludur. Fc parçası.

IgG serum Ig'sinin (12 g/l) yaklaşık %80'ini oluşturur. Birincil bağışıklık tepkisinin zirvesinde oluşurlar ve yeniden giriş antijen (ikincil yanıt). AG ile, özellikle bakteriyel yapıyla yeterince hızlı temasa sahip olun. IgG, AG epitoplarına bağlandığında, tamamlayıcı sistemin birinci fraksiyonunu sabitlemekten sorumlu olan bir bölge, Fc fragmanı bölgesinde açılır ve bunu klasik yol boyunca kompleman sisteminin aktivasyonu izler. IgG, plasentadan fetüse geçen tek antikor sınıfıdır. Çocuğun doğumundan bir süre sonra kan serumundaki içeriği düşer ve 3-4 ayda minimum konsantrasyona ulaşır, ardından kendi IgG'sinin birikmesi nedeniyle artmaya başlar ve 7 yaşında norma ulaşır. . Tüm Ig sınıfları arasında, IgG en çok Ò'de sentezlenir. IgG'nin yaklaşık %48'i kandan yayıldığı doku sıvısında bulunur.

IgM fetüste ilk sentezlenen ve bağışıklamadan sonra kan serumunda ilk ortaya çıkanlardır. Serum immünoglobulinlerinin (1 g/l) yaklaşık %13'ünü oluşturur. Mg'ye göre, Ig'nin geri kalanından çok daha büyüktürler, tk. 5 alt birimden oluşur. İzohemaglutininlerin (kan grupları) çoğu IgM'ye aittir. Plasentayı geçmezler ve en yüksek aviditeye sahiptirler. AG ile in vitro etkileşime girdiğinde, bunların aglütinasyonuna, çökelmesine veya tamamlayıcı fiksasyonuna neden olur.

IgA kan serumunda ve mukoza zarının yüzeyindeki sırlarda bulunur. Kan serumunda (10 yıl sonra) 2,5 g/l'dir. Serum IgA, dalak, lenf düğümleri ve mukoza zarlarının plazma hücrelerinde sentezlenir. Aglütine olmazlar ve AG'yi çökeltmezler, komplemanı aktive etmezler.

SIGA 2 veya 3 immünoglobulin A monomerleri ile ilişkili bir salgı bileşeninin (β-globulin) varlığı ile serumdan farklılık gösterir Salgı bileşeni, salgı epiteli hücreleri tarafından sentezlenir ve epitel hücrelerinden geçerken IgA'ya katılır. Yerel bağışıklıkta önemli bir rol oynarlar, MC'lerin epitel hücreleri üzerine yapışmasını önlerler. Kümelenmiş bir formda, tamamlayıcıyı alternatif bir yolla aktive eder.

Toplam IgA'nın yaklaşık %40'ı kanda bulunur.

IgD Kanda %75'e kadar bulunur (0.03 g/l). Plasentadan geçmez, kompleman bağlamaz. İşlevleri açıklığa kavuşturulmamıştır (muhtemelen B-lenfositlerinin öncüleri için reseptörlerden biridir).

IgE - kanda 0.00025 g / l, gastrointestinal sistemin mukoza zarında, lenf düğümlerindeki plazma hücreleri tarafından sentezlenir. REAGINS olarak da adlandırılırlar, çünkü. belirgin bir sitofilikliğe sahip olan anafilaktik reaksiyonlarda yer alırlar.

11. Spesifik olmayan faktörler koruma.