БАКТИСУБТИЛ

Югославия «Galenika»

Состав : в одной капсуле содержится не менее одного миллиарда вегетативных спор чистой сухой культуры Bacillus cereus штамма IP5832.

Синонимы: Flonivin - BS (Юг. «Galenika»).

Свойства: Bacillus cereus представляет собой спорогенную непатогенную живую бациллу для применения внутрь. Она отсутствует в нормальной кишечной флоре человека, а после введения внутрь выделяется во внешнюю среду приблизительно в течение 48 ч. В капсуле В.cereus находится в виде спор, высокоустойчивых к действию кислоты и пепсина желудка, а также панкреатических ферментов. Основной механизм действия бактисубтила - это микробный антагонизм и ферментная активность. Часть ферментов бактериолитична (лизирует протей, палочку коли и некоторые штаммы патогенных стафилококков), а другая обладает переваривающей способностью, что улучшает процессы пищеварения. Ферменты обеспечивают гидролиз глицидов.липидов и протидов (желатину, пептоны и т.д.). Пищевые жиры расщепляются липазой и лацитиназой.

При попадании спор в тощую кишку около 90% прорастает в вегетативные формы уже в первые 2 часа после приема препарата внутрь, оставшиеся 10% спор - в последующие 6 ч. Прорастание спор сопровождается проявлением ферментообразующей и антибиотической активности. За счет гидролиза сахара под влиянием гидролитической диастазы создается кислая среда, которая подавляет размножение гнилостной флоры и возможное развитие патогенных бактерий.

Следует отметить, что бактисубтил действует антагонистически только в отношении патогенной (например, энтеропатогенной E.coli) или условно патогенной микрофлоры кишечника. Штамм Bacillus IP 5832 генетически резистентен ко всем сульфаниламидам, гидразиду изоникотиновой кислоты, нистатину и многим антибиотикам широкого спектра действия (хлорамфениколу, окситетрациклину и др.).

Показания: бактериальная диарея как следствие суперинфекции в процессе лечения антибиотиками широкого спектра действия (профилактика и лечение), лечение метеоризма и его профи-

лактика перед рентгенологическим обследованием, неспецифическая диарея от сапрофитной микрофлоры (например, клебсиеллы); хронический неспецифический колит, энтерит, энтероколит; заболевания печени, сопровождающиеся образованием в кишечнике аммиака и других токсических продуктов.

Применение и дозировка : новорожденным детям до трех лет назначают до 3-4 капсул в день; перед применением капсулы следует вскрыть и содержимое смешать с пищей комнатной температуры - кашей, соком, подслащенной водой. Бактисубтил нетоксичен и может назначаться новорожденным сразу же после рождения даже в высоких дозах. Целые невскрытые капсулы не дают детям по причине возможности несчастного случая (асфиксии и т.д.).

Оглавление темы "Возбудитель сибирской язвы. Клинические проявления заражения сибирской язвой. Bacillus cereus.":

Bacillus cereus. Морфология bacillus cereus. Культуральные свойства bacillus cereus. Клиника отравлений bacillus cereus. Принципы микробиологической диагностики bacillus cereus. Выявление bacillus cereus.

Bacillus cereus - почвенная бактерия-сапрофит, широко распространённая в природе. Нередко бактерии обсеменяют пищевые продукты, вызывая пищевые отравления. Явления интоксикации опосредует энтеротоксин. Его образуют бактерии, прорастающие из спор, устойчивых к определённым термическим режимам обработки пищевых продуктов (обычно овощей). Бактерии образуют токсины только in vivo, во время прорастания спор. В последние годы также отмечены госпитальные инфекции, спорадически вызываемые В. cereus, - бактериемии, эндокардиты и менингиты у лиц с протезированными органами, катетерами, у пациентов с гемодинамическими нарушениями, а также у длительно получавших цитостатики и иммунодепрессанты. Поражения протекают тяжело и часто заканчиваются фатально.

Морфология и культуральные свойства bacillus cereus

Морфологически bacillus cereus напоминает сибиреязвенную палочку; основные отличия - подвижность и гемолитическая активность. В мазках бактерии располагаются в виде штакетника. Температурный оптимум роста 30 °С; оптимум рН 7-9,5. На агаре возбудитель образует «распластанные» колонии с неровными краями; на КА колонии окружены широкой зоной гемолиза (см. рис. 4 на вклейке). Со временем колонии приобретают характерный восковидный вид [от лат. сега, воск, свеча]. В жидких средах образуют нежную плёнку на поверхности, белый хлопьевидный осадок и помутнение бульона. Бактерии проявляют высокую протеолитическую активность и разжижают желатину за 1-4 сут; все штаммы образуют лецитиназу и ацетоин. Образуют кислоту на средах с глюкозой и мальтозой.

Клинические проявления отравлений bacillus cereus

Bacillus cereus вызывает два типа пищевых отравлений (гастроэнтеритов).

Отравления bacillus cereus первого типа отличает укороченный инкубационный период (около 4-5 ч); характерны изнуряющие диарея и рвота. Заболевание развивается при употреблении пищи, обсеменённой большим количеством микроорганизмов.

Отравления bacillus cereus второго типа отравлений отличает более продолжительный инкубационный период (около 17 ч). Больные жалуются на схваткообразные боли в животе, диарею. Этот комплекс симптомов часто ошибочно принимают за пищевые отравления, вызванные клостридиями.

Принципы микробиологической диагностики bacillus cereus

Диагностическим признаком bacillus cereus считают обнаружение в подозрительных пищевых продуктах более 10 5 бактерий в 1 г/мл продукта либо 10 2 -10 3 бактерий в 1 г/мл каловых и рвотных масс или промывных вод. Основные отличия В. cereus от В. anthracis - гемолитическая активность, подвижность, резистентность к пенициллину, быстрое разжижение желатины и непатогснность для белых мышей.

Зацепилова Тамара Анатольевна
Доцент кафедры фармакологии фармфакультета ММА им. И.М. Сеченова

Дисбактериоз — нарушение подвижного равновесия микрофлоры, в норме заселяющей нестерильные полости и кожные покровы человека.

При дисбактериозе нормальная микрофлора не подавляет активность патогенных и гнилостных микроорганизмов; нарушаются процессы пищеварения и усвоения питательных веществ, перистальтика кишечника; ухудшается синтез витаминов; снижается иммунитет. Причины дисбактериоза разнообразны: нарушение рациона питания, длительное применение лекарственных средств (противомикробных и др.), лучевая и химиотерапия, попадание в организм токсинов из окружающей среды (свинец, кадмий, ртуть и др), стрессовые состояния, кишечные инфекции, оперативные вмешательства, заболевания ЖКТ и др. Нарушение равновесия микрофлоры возникшее в ротовой полости, кишечнике, половых и мочевыводящих органах, на коже проявляются соответствующими симптомами. Напротив, дисбактериоз приводит к заболеваниям ЖКТ, ротовой полости, урогенитального тракта, аллергическим болезням, повышает риск развития злокачественных новообразований.

Для восстановления нормального микробиоцеоза применяются препараты, содержащие живые культуры микроорганизмов и различные вещества, способствующие избирательной стимуляции роста полезных микроорганизмов.

Показаниями к применению препаратов, восстанавливающих нормальную микрофлору, являются заболевания и состояния, вызванные дисбактериозом или напротив приводящие к дисбактериозу: заболевания ЖКТ (диарея, запор, колит, энтероколит, синдром раздраженной кишки, гастрит, дуоденит, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки), респираторных органов, урогенитального тракта, аллергические заболевания, длительный прием антибактериальных средств, гормонов, НПВС, острые кишечные инфекции, пищевые отравления, синдром мальабсорбции, коррекция микробиоценоза и профилактика гнойно-септических заболеваний перед и после операций на кишечнике, печени, поджелудочной железе и др.

ПРОБИОТИКИ (ЭУБИОТИКИ)

Препараты, содержащие культуры живых микроорганизмов. Пробиотики восстанавливают нормальный микробиоценоз. Находясь в кишечнике, они размножаются, угнетают патогенные и условно-патогенные микроорганизмы и создают благоприятные условия для развития нормальной микрофлоры.

В присутствии пробиотиков происходит индукция антител (IgA), активизация фагоцитарной функции лейкоцитов. Микроорганизмы, входящие в состав пробиотиков не патогенны, не токсичны, сохраняют жизнеспособность при прохождении через все отделы ЖКТ. Состав микроорганизмов, входящих в препараты пробиотиков, разнообразен и поэтому условно их можно разделить на несколько групп.

1. Монокомпонентные препараты:

Препараты, содержащие штамм одного вида бактерий.

Колибактерин (Escherichia coli штамма М 17), Бифидумбактерин (Bifidobacterium bifidum штамм 1).

Препараты, содержащие несколько штаммов бактерий одного вида.

Ацилакт , Аципол, Лактобактерин содержат смесь активных штаммов лактобактерий.

Сорбированные препараты.

Это один из видов монокомпонентных препаратов в особой лекарственной форме.

Бифидумбактерин форте и Пробифор содержат бактерии активного штамма Bifidobacterium bifidum No 1 адсорбированные на носителе — косточковом активированном угле. Иммобилизованные на частицах угля бифидобактерии быстро заселяют слизистую оболочку толстого кишечника и обеспечивают высокую локальную колонизацию. Препараты проявляют антагонизм к широкому спектру патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, адсорбируют и выводят из кишечника токсины.

2. Поликомпонентные препараты

Они состоят из нескольких видов бактерий.

Линекс — содержит живые лиофилизированные бактерии Bifidobacterium infantis v. liberorum, Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecium. Преимущество препарата Линекс состоит в том, что его можно принимать одновременно с антибиотиками и другими химиотерапевтическими средствами.

Бификол содержит микробную массу совместно выращенных живых бифидобактерий и кишечной палочки.

Бифиформ содержит Bifidobacterium longum и Enterococcus faecium.

Такое сочетание нормализует микрофлору кишечника и обеспечивает подавление значительного числа видов патогенных и условно-патогенных бактерий. Линекс и Бифиформ выпускаются в специальных капсулах, оболочка которых устойчива к действию желудочного сока. Это позволяет высвободить бактерии непосредственно в кишечнике.

3. Препараты конкурентного действия

Бактисубтил. В его состав входят споры бактерий Bacillus cereus IP 5832.
Споры устойчивы к действию желудочного сока. Прорастание спор бактерий происходит в кишечнике. Вегетативные формы бактерий продуцируют ферменты, которые способствуют образованию кислой среды, препятствующей процессам гниения и избыточного газообразования. Прорастание спор сопровождается интенсивной продукцией антибиотических веществ. Bacillus cereus IP 5832 проявляют выраженное антагонистическое действие к бактериям рода Proteus, Escherichia coli, Staphilococcus aureus.

Энтерол содержит микроорганизмы Saccharomyces boulardii, которые обладают прямым антимикробным действием в отношении широкого спектра бактерий: Clostridium difficile, Candida albicans, Candida krusei, Candida pseudotropicalis, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Yersinia enterocolitica, Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Staphilococcus aureus и простейших: Entamoeba histolitica, Lambliae.

Бактиспорин, Споробактерин содержат суспензию сенной палочки (Bacillus subtilis), которая выделяет антибактериальную субстанцию — антибиотик белковой природы, подавляющий развитие эшерихий, стафилококков, стрептококков, протеев, клебсиелл и других микроорганизмов.

ПРЕБИОТИКИ

Различные вещества, положительно влияющие на рост и активность микроорганизмов, присутствующих в ЖКТ. Пребиотики не подвергаются гидролизу пищеварительными ферментами человека, не абсорбируются в верхних отделах тонкого кишечника. Они достигают нижних отделов кишечника и усваиваются преимущественно бифидобактериями, оставаясь малодоступными для других видов микроорганизмов.

Пребиотиками являются ксилит, сорбит, фруктоолигосахариды, галактоолигосахариды, лактулоза, лацитол, инулин, валин, аргинин, глутаминовая кислота, пищевые волокна. Пребиотики содержатся в молочных продуктах, кукурузных хлопьях, крупах, хлебе, луки репчатом, цикории полевом, чесноке, фасоли, горохе, артишоке, бананах, топинамбуре и др. Они служат источником энергии для микроорганизмов. Пребиотики сбраживаются бифидобактериями до уксусной, молочной и других кислот, что ведет к снижению рН внутри толстой кишки и создает неблагоприятные условия для развития других родов бактерий, например сальмонелл. Образовавшиеся кислые продукты и другие метаболиты подавляют развитие гнилостной микрофлоры. В результате этого уменьшается количество колоний патогенных бактерий и токсичных метаболитов (аммиака, скатола, индола и др). Пребиотики не токсичны, их можно применять длительно.

Лактулоза (Дюфалак, Нормазе, Порталак) — синтетический олигосахарид, состоящий из остатков галактозы и фруктозы. Лактулоза попадает в толстый кишечник в неизмененном виде. Микрофлора толстой кишки гидролизует лактулозу с образованием кислот (молочной, частично муравьиной и уксусной). При этом в толстой кишке повышается осмотическое давление и снижается значение рН, что приводит к удержанию ионов аммония, переходу аммака из крови в кишечник и его ионизации. На фоне лактулозы идет активное размножение вводимых извне бифидобактерий и лактобактерий, а так же стимуляция роста естественной микрофлоры кишечника.

Хилак форте содержит концентрат продуктов обмена веществ нормальной микрофлоры кишечника (Escherichia coli, Streptococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus). Эти вещества являются источником питания кишечного эпителия, способствуют его регенерации и улучшению функции, нормализуют рН и водно-электролитный баланс, способствуют восстановлению нормальной микрофлоры, подавляют рост патогенных микроорганизмов. Препарат стимулирует иммунитет за счет увеличения синтеза IgА.

КОМБИНИРОВАННЫЕ ПРЕПАРАТЫ (СИНБИОТИКИ)

В состав этих препаратов входят пробиотики, пребиотики и другие вещества.

Бифилиз содержит бифидобактерии и лизоцим. Последний подавляет активность патогенных микроорганизмов, на этом фоне бифидумбактерии начинают активно заселять кишечник.

Нормофлорин-Л и Нормофлорин-Б содержит живые лакто- и бифидобактерии, культуральную среду их обитания (гидролизат козеина средней степени расщепления, пептиды, органические кислоты, витамины, ферменты), пребиотики — активаторы роста и метаболизма бактерий, не разлагающиеся в тонком кишечнике и доходящие в неизмененном виде до толстого кишечника.

Полибактерин содержит семь видов лакто- и бифидобактерий, обезжиренное молоко и концентрат топинамбура.

Восстановление микробиоценоза — длительный и сложный процесс, поэтому фармацевт должен предупредить больного о строгом соблюдении режимов дозирования этих препаратов и всех других предписаний, назначенных врачом.

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии, и может использоваться в бактериологических лабораториях для выявления антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893). Осуществляют совместную инкубацию в физиологическом растворе выделенного штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в чистой культуре и выделенной чистой культуры условно-патогенного микроорганизма (УПМ) из фекалий пациента. Полученную смесь высевают по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл и без него, и при выявлении снижения количества УПМ на среде с пенициллином по сравнению с количеством УПМ на среде без него определяют наличие антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штамма УПМ, при этом эубиотик оценивают как эффективный в отношении штамма УПМ, выделенного от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника. Изобретение обеспечивает подавление штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) без ущерба для всхожести тест-культур УПМ. 3 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии, и может использоваться в бактериологических лабораториях для выявления антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) с целью индивидуальной оценки эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является штамм Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893), в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника. Изобретение может быть использовано также в гастроэнтерологии для индивидуального подбора эубиотиков, основным действующим началом которых является штамм Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893), при лечении дисбактериоза кишечника.

Среди препаратов для коррекции измененного микробиоценоза кишечника важное место занимают эубиотики, предназначенные для подавления патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Наиболее часто в состав эубиотиков входят представители рода Bacillus, которые не являются представителями нормальной микрофлоры кишечника, элиминируются вскоре после отмены и являются мощными антагонистами неродственных микроорганизмов за счет продукции лизоцима, протеолитических ферментов и бактериоцинов . Известно, что наиболее эффективно бациллы подавляют патогенные энтеробактерии и некоторые условно-патогенные микроорганизмы, колонизирующие кишечный биотоп: S. aureus, Candida spp., E. coli, P. aeruginosa, K. pneumoniae и другие условно-патогенные энтеробактерии .

Одним из наиболее широко применяемых эубиотических препаратов во многих странах является препарат «Бактисубтил» (Франция), основным действующим началом которого является Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893) . Известен также эубиотик «Флонивин», основным действующим началом которого также является Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893), БС Производитель Galenika, A.D., Serbia.

Производственные штаммы рода Bacillus не формируют биопленок, поскольку их адгезивные свойства к эпителиальным клеткам кишечника слабо выражены. Исходя из того, что активность штамма Bacillus cereus осуществляется в просвете кишечника и связана, прежде всего, с высокой антагонистической активностью данного штамма, а не с конкурентными взаимоотношениями за места прикрепления к слизистой , то об эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893), в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациента при диагностике дисбактериоза кишечника, можно судить по наличию или отсутствию антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893).

Бактериоцины или бактериоциноподобные субстанции продуцируются бациллами преимущественно экстрацеллюлярно и способны накапливаться в питательной среде . Благодаря этому, теоретически антагонистическую активность бацилл можно выявить с использованием различных модификаций методов прямого или отсроченного антагонизма, традиционно используемых лишь для выявления антагонизма пробиотических лакто- и бифидобактерий: методом штрихов , методом отсроченного антагонизма по Фредерику с промежуточной убивкой штамма-продуцента хлороформом , методом двуслойного агара .

Для выявления антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) нами использовались вышеперечисленные методики.

Для оценки антагонистической активности бацилл методом прямого антагонизма по диаметру чашки Петри с питательным агаром штрихом засевали суспензию суточной культуры B.cereus в концентрации 1×10 9 по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Перпендикулярно подсевали культуры условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при диагностике дисбактериоза кишечника. Инкубировали при 37°С 24 часа. Наличие антагонистической активности учитывали по наличию задержки роста тест-штаммов.

При оценке антагонистической активности бацилл методом отсроченного антагонизма тест-культуры условно-патогенных микроорганизмов засевали через 24 и 48 ч после посева бацилл.

В рассмотренных вариантах оценки антагонизма штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), по собственным данным, штамм не проявлял антагонистической активности в отношении тест-культур условно-патогенных микроорганизмов (80 штаммов). Некоторые активно подвижные штаммы условно-патогенных микроорганизмов (P. aeruginosa, E. coli) росли на поверхности бациллярных колоний.

Считается, что метаболиты бацилл оказывают более мощное антагонистическое действие, нежели живые культуры . Поэтому нами была также использована методика отсроченного антагонизма с промежуточной убивкой штамма-продуцента хлороформом . Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893) засевали уколом в застывший 1,5% питательный агар, разлитый в чашки Петри, выращивали 48 часов при 37°С. После инкубации полученную культуру убивали парами хлороформа и наслаивали суспензию тест-культуры условно-патогенного микроорганизма. Для этого смешивали 0,1 мл культуры в конечной концентрации 10 8 клеток по оптическому стандарту мутности с 2,5-3 мл растопленного и остуженного до температуры 46-48°С 0,7% полужидкого агара. При наличии способности продуцировать бактериоцины должна наблюдаться зона ингибиции роста тест-штамма вокруг колонии штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893). Антагонистическая активность бацилл не выявлена, т.к. отмечался рост тест-культур УПМ «газоном» на поверхности среды с предполагаемыми бактериоцинами.

Аналогичные данные нами были получены методом модифицированного двуслойного агара с посевом бацилл газоном с последующей убивкой и наслаиванием тест-культуры УПМ.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является метод перевернутого агара, который описан для выявления антагонистической активности пробиотиков, содержащих Bacillus subtilis и Escherichia coli, в отношении оппортунистических дрожжей . Для этого штаммы Bacillus subtilis и Escherichia coli засевают газоном на плотную питательную среду, через 2 суток агар переворачивают и на его обратную сторону засевают предварительно оттитрованную посевную дозу дрожжей. Инкубируют 24 ч в аэробных условиях при 37°С. Наличие антагонизма выявляют количественно по подавлению роста дрожжей по сравнению с аналогичным посевом без пробиотических штаммов.

Метод перевернутого агара описан и протестирован для оценки антифунгального действия пробиотиков, содержащих Bacillus subtilis и Escherichia coli. Но оценка антагонистического влияния на другие условно-патогенные микроорганизмы (не оппортунистические дрожжи) не производилась. Кроме этого, оригинальная методика подразумевает подбор посевной дозы дрожжей, при которой на агаре вырастало бы не более 70 колоний. Это требует подтитровки и дополнительных исследований при тестировании каждого штамма. Проверка данной методики с использованием эубиотического штамма-продуцента Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) и 80 тест-культур условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при диагностике дисбактериоза кишечника, не позволила нам выявить ни одного случая антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893).

Для оценки антагонистической активности лакто- и бифидосодержащих пробиотиков также описаны методики совместного культивирования в жидкой среде с различными косвенными способами оценки , не подразумевающими последующий высев на плотную питательную среду для определения количества подавляемых УПМ.

Таким образом, ни один из известных способов выявления антагонистической активности пробиотических лакто- и бифидобактерий, по данным авторов, не позволил выявить антагонистическую активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

В литературных источниках нами также не обнаружен способ индивидуальной оценки эффективности препарата «Бактисубтил» или других эубиотических препаратов, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893), в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от конкретного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

Задачей изобретения является выявление антагонистической активности Bacillus cereus штамма IP 5832 (ATCC 14893) в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных у конкретного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

Техническим результатом изобретения является подавление эубиотического штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) без ущерба для всхожести тест-культур.

Технический результат достигается тем, что выделяют чистую культуру условно-патогенных микроорганизмов из фекалий обследуемого, затем выделяют Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893) в чистой культуре, после чего осуществляют совместную инкубацию штамма Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893) с каждым из штаммов условно-патогенных микроорганизмов в физиологическом растворе с последующим высевом по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл и без него, и при выявлении снижения количества условно-патогенных микроорганизмов на среде с пенициллином по сравнению с количеством условно-патогенных микроорганизмов на среде без пенициллина определяют наличие антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, при этом эубиотик оценивают как эффективный в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

Способ осуществляется следующим образом:

Стандартными способами выделяют чистую культуру условно-патогенных микроорганизмов из фекалий пациента и Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893) в чистой культуре, являющийся основным действующим началом эубиотика. Нами выделялась чистая культура Bacillus cereus штамма IP 5832 (АТСС 14893), из эубиотика «Бактисубтил». 1 мл суспензии тест-культуры условно-патогенного микроорганизма в физиологическом растворе в конечной концентрации 10 9 клеток по оптическому стандарту мутности смешивают с 1 мл суспензии Bacillus cereus в такой же концентрации. Смесь инкубируют 48 ч при 37°С. Затем осуществляют высев по Gold. Для этого проводят количественный высев мерной петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл для подавления бацилл и на среду без антибиотиков для контроля роста культур обоего типа. Для исключения других возможных факторов подавления роста УПМ и бацилл (отсутствие питательной основы) параллельно проводят контрольный высев монокультур после инкубации в аналогичных условиях. Количество выросших микроорганизмов подсчитывают по таблице 1 - Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости. При выявлении более одного УПМ из фекалий больного описанную процедуру осуществляют с каждым из УПМ. При выявлении снижения количества условно-патогенных микроорганизмов на среде с пенициллином по сравнению с контрольным высевом определяют наличие антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника. Наличие или отсутствие антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) является оценочным критерием для определения эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893), в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника. При наличии антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), эубиотик оценивают как эффективный в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

Существенными отличительными признаками заявляемого способа являются:

Выделяют чистую культуру условно-патогенных микроорганизмов из фекалий обследуемого;

Выделяют чистую культуру Bacillus cereus штамма IP 5832 (ATCC 14893), являющуюся основным действующим началом эубиотика;

После чего осуществляют совместную инкубацию штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) с каждым из штаммов условно-патогенных микроорганизмов в физиологическом растворе;

Последующий высев смеси на питательную среду по Gold;

Высев осуществляют на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл и без него;

При выявлении снижения количества условно-патогенных микроорганизмов на среде с пенициллином по сравнению с количеством условно-патогенных микроорганизмов на среде без пенициллина определяют наличие антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении штаммов условно-патогенных микроорганизмов;

При наличии антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении штаммов условно-патогенных микроорганизмов эубиотик оценивают как эффективный в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

Причинно-следственная связь между существенными отличительными признаками и достигаемым результатом:

Индивидуальность выявления антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении условно-патогенных микроорганизмов, а в свою очередь, и индивидуальность оценки эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893) в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника, обеспечивается выделением условно-патогенных микроорганизмов в чистой культуре из фекалий обследуемого и выделением чистой культуры Bacillus cereus штамма IP 5832 (ATCC 14893) с последующей совместной инкубацией в физиологическом растворе и высевом по Gold на питательную среду.

Высев по Gold на питательную среду необходим для определения количества подавляемых УПМ.

Питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл позволяет подавлять эубиотический штамм Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), без ущерба для всхожести тест-культур, что позволяет выявлять антагонистическую активность B. cereus в отношении условно-патогенных микроорганизмов.

В качестве тест-культур изучали штаммы условно-патогенных микроорганизмов, изолированные от пациентов с дисбактериозом кишечника - по 20 изолятов S. aureus, S. epidermidis, Klebsiella spp., E. coli с типичными свойствами, E. coli с измененной ферментативной активностью, Enterobacter spp., Citrobacter spp., P. aeruginosa.

1 мл суспензии тест-культур УПМ в физиологическом растворе в конечной концентрации 10 9 клеток по оптическому стандарту мутности смешивали с 1 мл суспензии Bacillus cereus штамма IP 5832 (АТСС 14893), в такой же концентрации. Во избежание размножения бацилл или условно-патогенных бактерий использование любых жидких питательных сред для совместной инкубации сочли нецелесообразным. Смесь инкубировали 48 ч при 37°С. Предполагалось, что в течение этого времени происходило отмирание УПМ под влиянием метаболитов бацилл. Проводили количественный высев мерной петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл по Gold. Высевали на питательный агар с антибиотиками для подавления бацилл и на среду без антибиотиков для контроля роста культур обоего типа. Для исключения других возможных факторов подавления роста УПМ и бацилл (отсутствие питательной основы) параллельно проводили контрольный высев монокультур после инкубации в аналогичных условиях. Количество выросших микроорганизмов подсчитывали по таблице 1 - Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости 1 .

Для подавления роста бацилл на среде высева предварительно подобрали селективную добавку - антибиотик в концентрации подавляющей бациллы, но не угнетающей рост микроорганизмов, исходя из данных о распространенной среди тестируемых условно-патогенных бактерий (особенно энтеробактерий) устойчивости к пенициллину и стрептомицину . В растопленный и остуженный до 46-48°С питательный агар вносили разные концентрации антибиотиков. При тестировании сред со стрептомицином препарат вносили в концентрациях 1,0 ЕД/мл, 0,5 ЕД/мл, 0,25 ЕД/мл среды. Засевали 25 культур УПМ и Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893) в концентрации 10 9 клеток/мл на среды с антибиотиками и без них. Однако рост бацилл подавлялся не полностью - с 10 9 до 10 4 клеток/мл при максимальной концентрации стрептомицина 1,0 ЕД/мл среды. В то же время выделенные при диагностике дисбактериоза культуры УПМ (Klebsiella spp., Enterobacter spp., атипичные E. coli, Citrobacter spp., S. aureus) в разной степени подавлялись стрептомицином в 74 (96%) тестах (Таб.2 - Подбор антибиотика для подавления Bacillus cereus штамма IP 5832 (АТСС 14893) и одновременного роста условно-патогенных микроорганизмов).

При тестировании сред с пенициллином добавляли препарат в концентрациях 0,001 ЕД/мл, 0,01 ЕД/ мл, 0,1 ЕД/мл, 1,0 ЕД/мл среды. Посев и учет результатов проводили аналогично. Условно-патогенные энтеробактерии не подавлялись даже максимальной концентрацией пенициллина 1,0 ЕД/мл среды. Отмечалось более интенсивное подавление S. aureus. Приемлемый уровень всхожести условно-патогенных бактерий, включая S. aureus, при одновременном полном подавлении штамма Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893) отмечался при концентрации пенициллина 0,01 ЕД/ мл питательной среды (Табл.2 - Подбор антибиотика для подавления штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) и одновременного роста условно-патогенных микроорганизмов).

При наличии антагонистической активности Bacillus cereus штамма IP 5832 (АТСС 14893) в отношении условно-патогенных микроорганизмов эубиотик оценивают как эффективный в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

Оценочным критерием для индивидуальной оценки эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893), в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника, нами выбрана антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893). Это объясняется тем, что активность штамма Bacillus cereus осуществляется в просвете кишечника и связана, прежде всего, с высокой антагонистической активностью данного штамма, а не с конкурентными взаимоотношениями за места прикрепления к слизистой.

Совокупность существенных отличительных признаков заявляемого способа является новой и позволяет подавлять эубиотический Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893) без ущерба для всхожести тест-культур, что, в свою очередь, обеспечивает выявление антагонистической активности эубиотического штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при исследовании на дисбактериоз кишечника от пациента, что может быть использовано при индивидуальной оценке эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893), в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

Примеры конкретного выполнения:

При бактериологическом исследовании кала на дисбактериоз кишечника (№ 247) выявлен Citrobacter freundii в количестве 5×10 6 КОЕ/г.

1 мл суспензии чистой культуры Citrobacter freundii, выделенной из фекалий пациента, в физиологическом растворе в конечной концентрации 10 клеток по оптическому стандарту мутности смешивали с 1 мл суспензии чистой культуры Bacillus cereus штамма IP 5832 (ATCC 14893), выделенной из эубиотика "Бактистатин", в такой же концентрации. Смесь инкубировали 48 ч при 37°С. Затем проводили количественный высев мерной петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл для подавления бацилл и на среду без антибиотиков для контроля роста культур обоего типа. Количество выросших микроорганизмов подсчитывали по таблице 1 - Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости.

В контрольном варианте концентрация Citrobacter freundii составила 10 8 КОЕ/г, в опытном варианте 5×10 КОЕ/г. Выявлена антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении штамма Citrobacter freundii (№ 247). Препарат «Бактисубтил» определяют как эффективный в отношении штамма Citrobacter freundii, выделенного от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

При бактериологическом исследовании кала на дисбактериоз кишечника (№ 512) выявлен S aureus в количестве 10 6 КОЕ/г.

1 мл суспензии чистой культуры S aureus, выделенной из фекалий пациента, в физиологическом растворе в конечной концентрации 10 9 клеток/мл по оптическому стандарту мутности смешивали с 1 мл суспензии чистой культуры Bacillus cereus штамма IP 5832 (ATCC 14893), выделенного из эубиотика «Бактисубтил», в такой же концентрации. Смесь инкубировали 48 ч при 37°С. Затем проводили количественный высев мерной петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл для подавления бацилл и на среду без антибиотиков для контроля роста культур обоего типа. Количество выросших микроорганизмов подсчитывали по таблице 1 - Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости.

В контрольном варианте концентрация S aureus составила 5×10 6 КОЕ/г, в опытном варианте - 10 6 КОЕ/г. Антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении штамма S aureus не выявлена (№ 512). Препарат «Бактисубтил» определяют как неэффективный в отношении штамма S aureus, выделенного от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

При бактериологическом исследовании кала на дисбактериоз кишечника (№ 429) выявлены Klebsiella pneumoniae в количестве 10 4 КОЕ/г, Enterobacter agglomerans в количестве 10 6 КОЕ/г, Citrobacter freundii в количестве 10 6 КОЕ/г, Staphylococcus aureus в количестве 10 4 КОЕ/г.

1 мл суспензии чистой культуры каждого из выделенных от пациента штаммов условно-патогенных микроорганизмов, в физиологическом растворе в конечной концентрации 10 9 клеток по оптическому стандарту мутности смешивали с 1 мл суспензии чистой культуры Bacillus cereus штамма IP 5832 (АТСС 14893), выделенного из эубиотика «Бактисубтил», в такой же концентрации. Таким образом получили 4 смеси штаммов условно-патогенных микроорганизмов и бацилл. Смеси инкубировали 48 ч при 37°С. Затем проводили количественный высев мерной петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл для подавления бацилл и на среду без антибиотиков для контроля роста каждой из выделенных культур. Количество выросших микроорганизмов подсчитывали по таблице 1 - Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости.

В контрольном варианте концентрация Klebsiella pneumoniae составила 10 8 КОЕ/г, в опытном варианте 10 6 КОЕ/г. В контрольном варианте концентрация Enterobacter agglomerans составила 10 7 КОЕ/г, в опытном варианте 10 5 КОЕ/г. В контрольном варианте концентрация Staphylococcus aureus составила 10 8 КОЕ/г, в опытном варианте 5×10 6 КОЕ/г. В контрольном варианте концентрация Citrobacter freundii составила 10 7 КОЕ/г, в опытном варианте 10 6 КОЕ/г.

Выявлена антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штаммов Klebsiella pneumoniae, Enterobacter agglomerans, Staphylococcus aureus, Citrobacter freundii. Препарат «Бактисубтил» определяют как эффективный в отношении данных штаммов, выделенных от данного пациента при исследовании на дисбактериоз.

При бактериологическом исследовании кала на дисбактериоз кишечника (№ 449) выявлены Enterobacter agglomerans в количестве 10 6 КОЕ/г, Klebsiella pneumoniae в количестве 5×10 4 КОЕ/г, Citrobacter freundii в количестве 10 6 КОЕ/г.

1 мл суспензии чистой культуры каждого из выделенных штаммов условно-патогенных микроорганизмов в физиологическом растворе в конечной концентрации 10 9 клеток по оптическому стандарту мутности смешивали с 1 мл суспензии чистой культуры Bacillus cereus штамма IP 5832 (АТСС 14893), выделенного из эубиотика «Бактисубтил», в такой же концентрации. Таким образом получили 3 смеси штаммов условно-патогенных микроорганизмов и бацилл. Смеси инкубировали 48 ч при 37°С. Затем проводили количественный высев мерной петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/ мл для подавления бацилл и на среду без антибиотиков для контроля роста каждой из выделенных культур. Количество выросших микроорганизмов подсчитывали по таблице 1 - Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости.

В контрольном варианте концентрация Enterobacter agglomerans составила 10 8 КОЕ/г, в опытном варианте 5×10 7 КОЕ/г. В контрольном варианте концентрация Klebsiella pneumoniae составила 10 7 КОЕ/г, в опытном варианте 5×10 6 КОЕ/г. В контрольном варианте концентрация Citrobacter freundii составила 10 7 КОЕ/г, в опытном варианте 5×10 5 КОЕ/г.

Выявлена антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штамма Citrobacter freundii, не выявлена антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штаммов Enterobacter agglomerans и Klebsiella pneumoniae. Препарат «Бактисубтил» определяют как эффективный в отношении штамма Citrobacter freundii и неэффективный в отношении штаммов Enterobacter agglomerans и Klebsiella pneumoniae, выделенных от данного пациента при исследовании на дисбактериоз.

При бактериологическом исследовании кала на дисбактериоз кишечника (№ 461) выявлены Klebsiella pneumoniae в количестве 10 6 КОЕ/г и Citrobacter freundii в количестве 10 6 КОЕ/г.

1 мл суспензии чистой культуры каждого из выделенных штаммов условно-патогенных микроорганизмов в физиологическом растворе в конечной концентрации 10 9 клеток по оптическому стандарту мутности смешивали с 1 мл суспензии чистой культуры Bacillus cereus штамма IP 5832 (АТСС 14893), выделенного из эубиотика «Бактисубтил», в такой же концентрации. Таким образом получили 2 смеси штаммов условно-патогенных микроорганизмов и бацилл. Смеси инкубировали 48 ч при 37°С. Затем проводили количественный высев мерной петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/ мл для подавления бацилл и на среду без антибиотиков для контроля роста всех выделенных культур. Количество выросших микроорганизмов подсчитывали по таблице 1 - Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости.

В контрольном варианте концентрация Klebsiella pneumoniae составила 10 7 КОЕ/г, в опытном варианте 5×10 5 КОЕ/г. В контрольном варианте концентрация Citrobacter freundii составила 10 8 КОЕ/г, в опытном варианте 5×10 7 КОЕ/г.

Выявлена антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штамма Klebsiella pneumoniae и не выявлена антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штамма Citrobacter freundii. Препарат «Бактисубтил» определяют как эффективный в отношении штамма Klebsiella pneumoniae и неэффективный в отношении штамма Citrobacter freundii, выделенных от данного пациента при исследовании на дисбактериоз.

С использованием разработанной среды с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл изучали антагонизм штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) Да и 96 культур УПМ, выделенных в значимом количестве при исследовании на дисбактериоз кишечника: Citrobacter spp. (16 штаммов), Klebsiella spp. (17), S. aureus (18), Enterobacter spp. (15), типичная E. coli (15), E. coli с атипичными свойствами (15). Антагонистическую активность эубиотика оценивали по числу подавляемых им штаммов тестируемых микроорганизмов (в %) (Табл. 3 - Антагонизм штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) и условно-патогенных микроорганизмов).

Исследования показали, что изучаемый штамм Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) подавляет 17,7% (17 изолятов) испытуемых штаммов УПМ.

Однако снижение количества условно-патогенных микроорганизмов было незначительным - на 0,5-2 lg. Устойчивыми и даже способными к размножению в присутствии эубиотика оказались 79,0% (81 изолят) испытуемых штаммов.

Заявляемый способ позволяет подавлять эубиотический штамм Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893) без ущерба для всхожести тест-культур, что, в свою очередь, обеспечивает выявление антагонистической активности эубиотического штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного при диагностике дисбактериоза кишечника у пациента, что может быть использовано при индивидуальной оценке эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893), в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

Таблица 1
Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости
А	I	II	III	К-во в 1 мл
1-6	-	-		<1000
8-20	-	-	-	3000
20-30	-	-	-	5000
30-60	-	-	-	10000
70-80	-	-	-	50000
100-150	5-10	-	-	100000
не сосч.	20-30	-	-	500000
-"-	40-60	-	-	1 млн.
-"-	100-150	10-20	-	5 млн.
-"-	не сосч.	30-40	-	10 млн.
-"-	-"-	60-80	Единичные колонии	100 млн.
Таблица 2
Подбор антибиотика для подавления штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) и одновременного роста условно-патогенных микроорганизмов
Рост УПМ при данной концентрации антибиотика, КОЕ/мл	Количество штаммов УПМ, выросших при данной концентрации антибиотика, абс (%)
Стрептомицин, ЕД/мл среды	Пенициллин, ЕД/мл среды
1,0	0,5	0,25	1,0	0,01	0,01	0,001
10 8 (идентично контролю)	1 (4)	8 (32)	10 (40)	16 (64)	19 (76)	22 (88)	23 (92)
10 6	4 (16)	2 (8)	0	4 (16)	3 (12)	3 (12)	2 (8)
10 5	15 (60)	12 (48)	15 (60)	5 (20)	3 (12)	0	0
10 4	3 (12)	3(12)	0	0	0	0	0
<10 4	2 (8)	0	0	0	0	0	0
Рост Bacillus cereus при данной концентрации антибиотика, КОЕ/мл	10 4	10 4	10 4	Отс.	Отс.	Отс.	10 4

Таблица 3
Антагонизм штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) и условно-патогенных микроорганизмов
Тест-культуры УПМ	Кол-во штаммов	Чувствительные штаммы абс (%)	Устойчивые штаммы абс (%)*
Снижение на 1 lg	Снижение на 2 lg	Всего устойчивых штаммов	Из них способны к росту в присутствии эубиотика**
Klebsiella spp	17	1 (5,9)	0	16(94,1)	1 (6.25)
Enterobacter spp	15	4 (26,7)	1 (6,6)	10 (66,7)	1(10)
Citrobacter spp	16	5(31,3)	0	11 (68,7)	1 (9,1)
типичная E. coli	15	1 (6,7)	0	14 (93,3)	0
атипичная E. coli	15	2(13,3)	0	13 (86,7)	1 (7,7)
S. aureus	20	3 (15,0)	0	17 (85,0)	6 (35,3)
* - количество УПМ по сравнению с контролем не изменилось или изменилось не более, чем на 0,5 lg ** - количество УПМ по сравнению с контролем увеличилось

Источники информации

1. Осипова И.Г., Михайлова Р.А., Сорокулова И.Б., Васильева Е.А., Гайдеров А.А. Споровые пробиотики // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунологии. - 2003. - № 3. - С.113-119.

2. Блинкова Л.П., Семенова С.А., Бутова Л.Г. и др. Антагонистическая активность свежевыделенных штаммов бактерий рода Bacillus // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунологии. - 1994. - № 5. - С.71-75.

3. Штаммы бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis, используемые в качестве компонентов препарата против вирусных и бактериальных инфекций, и препарат на основе этих штаммов. / Патент RU 2142287 , опубл. 10.12.99. - Бюл. N20.

4. Штамм бактерий Bacillus subtilis, обладающий широким спектром антагонистической активности. / Патент RU N2182172, опубл. 10.05.02.

5. Гатауллин А.Г., Михайлова Н.А., Блинкова Л.П., Романенко Э.Е., Елкина С.И., Гайдеров А.А., Калина Н.Г. Свойства выделенных штаммов Bacillus subtilis и их влияние на интестинальную микрофлору экспериментальных мышей // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунологии. - 2004. - № 2. - С.91-94.

6. Давыдов Д.С., Мефед К.М., Осипова И.Г., Васильева Е.А. Мировое применение споровых пробиотиков в практике здравоохранения // Клиническое питание. - 2007. - № 1-2. - С.А36.

7. Сорокулова И.Б. Влияние пробиотиков из бацилл на функциональную активность макрофагов // Антибиотики и химиотерапия. - 1998. - № 2. - С.20-23.

8. Блинкова Л.П. Бактериоцины: критерии, классификация, свойства, методы выявления // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунологии. - 2003. - № 3. - С.109-113.

9. Постникова Е.А., Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская Л.И. Поиск перспективных штаммов бифидобактерий и лактобацилл для разработки новых биопрепаратов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2004. - № 2. С.64-69.

10. Gratia A., Fredericq P. Deversite des souches antibiotiques de Escherichia coli et etendue varibile de leur champ d"action. Ibid: 1031-1033.

11. Fredericq P. Actions antibiotiques reciproques chez les Enterobacteriaceae. REV. Belge Pathol. Med. Exp.1948, 19 (Suppl. 4): 1-107.

12. Ермоленко Е.И., Исаков В.А., Ждан-Пушкина С.Х., Тец В.В. Количественная оценка антагонистической активности лактобацилл // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунологии. - 2004. - № 5. - С.94-98.

13.Ушакова Н.А., Чернуха Б.А. Влияние температурного шока на биологическую эффективность пробиотика Bacillus subtilis 8130 // Клиническое питание. - 2007. - № 1-2. - С.А70.

14. Арзуманян В.Г., Михайлова Н.А., Гайдеров А.А., Баснакьян И.А., Осипова И.Г. Количественный способ оценки отсроченного антагонизма пробиотических культур против оппортунистических дрожжей // Клиническая лабораторная диагностика. - 2005. - № 5. С.53-54.

15. Способ определения антагонистической активности пробиотиков. / RU Патент № 2187801, опубл. 20.08.2002.

16. Зыкова Н.А., Молокеева Н.В. Новый пробиотический препарат «Трилакт» // Клиническое питание. - 2007. - № 1-2. - С.А42.

17. Методические указания по применению унифицированных микробиологических (бактериологических) методов исследования в клинико-диагностических лабораториях: приложение 1 к приказу Минздрава СССР № 535. - 1986.

18. Sanford Jay P., Gilbert David N., Moeliering Robert C. Jr., Sande Merle A. Twenty-ninth edition The Sanford Guid to antimicrobial therapy, 1999.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ индивидуальной оценки эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893), в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника, заключающийся в том, что выделяют условно-патогенные микроорганизмы в чистой культуре из фекалий обследуемого, затем выделяют Bacillus cereus ШТАММ IP 5832 (АТСС 14893) в чистой культуре, после чего осуществляют совместную инкубацию штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) с каждым из штаммов условно-патогенных микроорганизмов в физиологическом растворе с последующим высевом по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл и без него, и при выявлении снижения количества условно-патогенных микроорганизмов на среде с пенициллином по сравнению с количеством условно-патогенных микроорганизмов на среде без пенициллина определяют наличие антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, при этом эубиотик оценивают как эффективный в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

На правах рукописи

Гатауллин Айрат Гафуанович

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ШТАММОВ BACILLUS SUBTILIS, ПЕРСПЕКТИВНЫХ ДЛЯ СОЗДАНИЯ НОВЫХ ПРОБИОТИКОВ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. ИИ. Мечникова РАМН, г. Москва.

Научные руководители: доктор медицинских наук,

профессор Михайлова НА. доктор биологических наук Блинкова Л.П.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Батуро А.П. доктор медицинских наук, профессор Лиходед В.Г.

Ведущая организация: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Национальный орган контроля Федеральное государственное учреждение науки ГосНИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича

Защита состоится ¿3" и&иЯ 2005 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при ГУ Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательского института вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова РАМН.

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В медицинской микробиологии накопились данные, обосновывающие использование для коррекции дисбиотических нарушений сапрофитной микрофлоры, микроорганизмы которой в процессе своей жизнедеятельности вырабатывают биологически активные вещества (БАВ), подавляющие рост патогенных микроорганизмов [Михайлова Н.А. и др., 1993; Мазанкова Л.Н. и др, 1997; Осйпова И.Г. и др., 2003].

Лечебные и профилактические препараты на основе живых непатогенных микробов, способные оказывать при естественном способе введения благоприятные эффекты на физиологические и биохимические функции организма хозяина через оптимизацию его микробиологического статуса, относят к препаратам - пробиотикам [Шендеров Б.А., 1997].

Для профилактики и лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта широко используют биопрепараты на основе живых микробных культур спорообразуюших бактерий [Слабоспицкая А.Т. и др., 1990; Никитенко В.И., 1991; Никитенко Л.И., Ни-китенко В.И., 1992; Смирнов В.В. и др., 1995; Шендеров Б.А. и др., 1997; Поберий ИА. и др., 1998].

Род Bacillus привлекает внимание исследователей с давних времен. Сведения, полученные в области микробиологии, биохимии, физиологии и генетики бактерий, свидетельствуют о преимуществах Bacillus как продуцентов биологически активных веществ: ферментов, антибиотиков, инсектицидов [Смирнов В.В и др., 1982; Паршина С.Н. и др, 1990; Харвуд К., 1992; Блинкова Л.П. и др, 1994].

Разнообразие метаболических процессов, генетическая и биохимическая вариабельность, устойчивость к литическим и пищеварительным ферментам послужили обоснованием использования бацилл в различных областях медицины. Управление по контролю за качеством продовольственных и лекарственных средств США, присвоило В. subtilis статус GRAS (generally regarded as safe) го безопасности, являющейся обязательным условием для их применения при производстве лекарственных препаратов [Харвуд К., 1992; Никитенко Л.И., 1992; Кандыбин Н.В. и др., 1995; Ивановский АА., 1996, 1997; Бойко Н.В и др, 1997; Payne J. М, 1992; Kubo К, 1994; Tsuge К. et al., 1995; Rychen G. et al., 1995, Donovan W.P. et al., 1995].

Активность многих представителей рода Bacillus ярко выражена и проявляется в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов Благодаря синтезу разнообразных ферментов и других веществ они регулируют и стимулируют пищеварение, оказывают противоаллергенное и антитоксическое действие Применение бацилл существенно повышает неспецифическую резистентность макроорганизма Кроме того, эти микроорганизмы технологичны в производстве, стабильны при хранении и, что существенно важно, экологически безопасны [Сороку ю-ва И Б, 1996]

Наибольший интерес для биотехнологии представляет вид В sub lilts Для него создан банк данных по молекулярной генетике SubtiList, в который вносят всю информацию о бактериальном геноме

Бактерии В subtilis широко используются в технологии получения ряда бактериальных и ферментных препаратов [Шаблинскас АИ, 1990, Гулько МА, 1994, Gastro GR, 1992, Dercova К et al, 1992, Kudrya VA, 1994, Lin S-C et al, 1994, Cromwick AM et al, 1996, Buchell M E et al, 1997, Oh M К et al, 1995]

На их основе созданы препараты - пробиотики, характеризующиеся широким диапазоном лечебно-профилактического действия и экологической безопасностью [Нахабин И М, Перелыгин В В, 1996] Споровые пробиотики эффективно используют для лечения желудочно-кишечных заболеваний у человека и сельскохозяйственных животных [МПТопчий, 1997, VGuida, 1978, Харченко, 1980, Никитенко В И, 1992]

Наиболее известными в настоящее время являются следующие препараты бак-тису бтил, споробактерин, биоспорин, бактиспорин, субалин, цереобиоген, энтерогер-мин и другие [Смирнов В В и др 1988, 1992, 1995,1997, Никитенко В И, 1989, 1991, 1992, Грачева Н М и др, 1996, Винник Ю Си др,1998, Сорокулова И Б, 1996, 1997, St gard H , 1989, Maruta К, 1996, Su Li et al, 1996, Adami A et al, 1997]

Терапевтическая эффективность споровых пробиотиков обеспечивается биологическими свойствами штаммов, используемых для их производства Определяющее значение при этом имеет спектр их антагонистической активности в отношении патогенных и условно патогенных микроорганизмов, являющихся одной из причин нару-

шений микроэкологии в различных биотопах организма человека или животных Кроме того, нельзя не учитывать способности бацилл к продукции различных БАВ, таких, как полипептидные антибиотики, ферменты, бактериоцины и др., а также их антибиотикорезистентность.

Цель работы:

Изучить биологические свойства выделенных штаммов B.subtilis и оценить возможность их использования для разработки оригинального спорового пробиотика

Задачи исследования:

Научная новизна.

На основе изучения морфологических, физиолого-биохимических, генетических и других биологических свойств выделенных штаммов отобран бесплазмидный штамм B.subtilis 1719, проявляющий антагонизм против условно патогенных и патогенных микроорганизмов различных таксономических групп, обладающий низкой адгезивной активностью, устойчивый к гентамицину, полимиксину и эритромицину.

Экспериментально обоснованы подходы к созданию производственной технологии, включающие изучение ростовых свойств штамма B.subilhs 1719 на оригинальных питательных средах, условий стабилизации его жизнеспособности и антагонистической активности как этапов получения нового препарата-пробиотика

Подана заявка на изобретение (№2005111301 от 19 04.2005 г.): «Штамм бактерий Bacillus subtlll.4 1719 - продуцент антагонистически активной биомассы в отношении болезнетворных микроорганизмов, а также протеолитических, амилолитиче-ских и липолитических ферментов».

Практическая значимость.

Выделенный и идентифицированный штамм B.SllbtlllS 1719 депонирован в Государственной коллекции культур ГИСК им. Л.А. Тарасевича под №277 и может быть рекомендован для разработки промышленной технологии получения оригинального биотерапевтического препарата-пробиотика.

1. Выделенные три штамма бактериальных культур по морфологическим, фи-зиолого-биохимическим и другим свойствам соответствуют виду В. suhlllts. Они не содержат плазмид, антагонистически активны в отношении условно патогенных и патогенных бактерий разных таксономических групп, имеют низкий или средний уровень адгезии.

2. Штамм B.subtlhs 1719 обладает пробиотическими свойствами, проявляющимися в элиминации условно патогенных и патогенных микроорганизмов с восстановлением количественного и качественного состава нормальной микрофлоры при экспериментальном дисбиозе, а также оказывает иммуномодулирующее действие на макроорганизм.

Апробация работы

Материалы доложены на конференции «Функциональное питание, пищевая безопасность и здоровье людей в условиях мегаполиса» (Москва, 2003); на конкурсе молодых ученых ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова (Москва, 2004); на обществе

ВОЭМП (Москва, 2004); на 8-ой Международной Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2004); на 5-ом съезде «Научного общества гастроэнтерологов» (Москва 2005).

Апробация диссертации состоялась на научной конференции отдела микробиологии НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН (Москва, май 2005 г.).

Объем и структура диссертационной работы

Диссертация изложена на 131 странице. Она состоит из введения, обзора литературы (2 главы), собственных результатов (5 глав), заключения и выводов. Список литературы включает: 236 источников (169 отечественных и 67 зарубежных). Работа содержит 10 рисунков и 19 таблиц.

Объекты исследований

Штаммы: Bacillus subtilis, изолированные из различных источников окружающей среды.

Культуры микроорганизмов, выделенные от мышей при экспериментальном дис-биозе.

Тест - культуры, используемые для определения антагонистической активности, из коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича

Питательные среды:

Мясопептонный агар (МПА), мясопептонный бульон (МПБ), модифицированная среда Гаузе № 2, питательный агар с добавлением 7% NaCl - для выращивания культур, 5% кровяной агар для определения гемолитических свойств, яичный бульон для тестирования лецитиназной активности, казеиновый и картофельный агары для определения ферментативных свойств, АГВ - для оценки антибиотикоустойчивости.

Биохимические свойства бацилл определяли на средах Омелянского с индикатором бромтимоловым синим и карбогидратами - глюкозой, ксилозой, маннитом, лактозой, сахарозой, мальтозой, салицином и эскулином. Для бесспоровых культур использовали углеводсодержащие среды Гисса и среды с аминокислотами.

Утилизацию цитрата и пропионата тестировали на среде Козера, способность восстанавливать нитраты - на бульоне с нитратами. Определение в среде ацетоина

(реакция Фогеса-Проскауэра) проводили на среде Кларка. Способность продуцировать сероводород изучали на среде Клиглера; каталазную активность выявляли в реакции с Н2О2, способность культур вырабатывать индол - на питательном бульоне с индикаторной бумагой; фермент уреазу - на среде Кристенсена с мочевиной.

Кроме того, для изучения структуры микрофлоры мышей использовали холодный сывороточный бульон и раствор Хенкса, дифференциально-диагностические среды: Эндо, СЫ-агар, Плоскирева, стафилококковый и энтерококковый агары, 88-агар, среду Мас-Сопкеу, цетримидный агар, среду Блаурокка, тиогликолевую среду, среду Вильсона Блера и другие.

Для оценки ростовых свойств использовали следующие среды:

Полусинтетическая среда с добавлением картофельно-глицеринового гидроли-зата [Михайлова Н.А. 1995].

Среда № 5 (г/л): калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный - 0,3; аммоний сернокислый двузамещенный - 2; натрий лимоннокислый 5,5- водный - 2; медь сернокислая 5-водная - 0,005; цинк сернокислый 7-водный - 0,004; железо (II) сернокислое 7-водное - 0,0005; кальций хлористый - 0,165; марганец (II) сернокислый 5-водный - 0,05; магний сернокислый 7-водный - 0,3; пептон сухой ферментативный для бактериологических целей - 5.

Среда № 9 (г/л): железо (II) сернокислое 7-водное - 0,01; магний сернокислый 7-водный - 0,1; кальций хлористый - 0,08; пептон сухой ферментативный для бактериологических целей - 5,0; глюкоза - 10,0, дрожжевой экстракт - 3.

Среда ВК-2 (г/л): марганец хлористый - 0,01; кальций хлористый - 0,05; натрий хлористый - 5,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный - 2,0; калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный - 2,0; глюкоза - 10,0, пептон сухой ферментативный для бактериологических целей - 10,0.

Среда СПАС-2 (г/л): калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный - 2,5; натрий хлористый - 5,0; крахмал - 2,5; гидролизат Модифицированной сои - 10,0; пептон сухой ферментативный для бактериологических целей - 10,0.

Среда СПАС-4 (г/л): натрий хлористый - 5,0, гидролизат Модифицированной сои - 10,0; экстракт кормовых дрожжей - 1,0; кислотный гидролизат казеина - 5,0.

Среда СПАС-6 (г/л), калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный - 2,5; натрий хлористый - 5,0, казаминовые кислоты 5,0; гидролизат немодифицированной сои - 10.0, крахмал - 2,5.

Методы исследований

Выделение и идентификацию штаммов микроорганизмов проводили путем высева на дифференциально-диагностические питательные среды в чашках Петри или в пробирках. Культуры помещали в термостат при 37 °С на 18-24 ч. После учета посевов, готовили мазки, окрашивали их по Граму, микроскопировали и отбирали культуры спорообразуюших бактерий [Смирнов В.В., 1983, Murray P.R., 1999]

Изучение морфологии бактериальных колоний.

Для изучения морфологии колоний в микробной популяции готовили 10-кратные разведения исходной культуры в 0,9 % физиологическом растворе и высевали на среду МПА [Смирнов В.В., 1983, Murray P.R., 1999].

Изучение концентрации биомассы.

Концентрацию микробных клеток в культуральной жидкости определяли, используя отраслевой стандартный образец мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича на 10 ЕД.

Определение чувствительности штаммов к антибиотикам

Чувствительность штаммов к антибиотикам изучали диско-диффузионным методом, используя стандартные диски, пропитанные антибиотиками, на среде АГВ [Биргер М.О., 1982; Решедько Г.К., 2003; МУК 4.2.1980-04, 2004]

Физиолого-биохимические свойства изучали по способности утилизировать различные углеводы: глюкозу, ксилозу, маннит, сахарозу, мальтозу и эскулин, лактозу и салицин; по образованию газа при расщеплении глюкозы; по способности расти на средах в присутствии 7% NaCl, восстанавливать нитраты, продуцировать индол, сероводород, синтезировать ферменты: уреазу, протеазу, амилазу и липазу. Оценивали также подвижность штаммов.

Токсичность, токситенпость и вирулентность выделенных штаммов определяли на белых беспородных мышах массой 14-16 г, в соответствии с рекомендованными методиками [Смирнов В.В., 1983, Murray P.R., 1999].

Адгезивную активность штаммов В. sub tills определяли по методу В Брилиса. оценивая индекс адгезии микроорганизмов (НАМ) Адгезию считали низкой при НАМ 1,00 - 2.49, средней при ИАМ 2,5 - 3,99, высокой при ИАМ > 4,0 [Брилис В И., 1982,1990]

Антагонистическую активность тестировали методом отсроченного антагонизма по отношению к полученным из коллекции ГИСК им. Л.А.Тарасевича тест - штаммам, используемым при оценке показателей качества препаратов-пробиотиков, [Бойко Н.В., 1989;БлинковаЛ.П. 1994].

Цитотоксический тест для определения концентрации ФНО - а Концентрацию ФНО - а определяли по цитотоксическому действию сыворотки мышей на клетки-мишени линии L929 .

Фагоцитарную активность нейтрофилов исследовали в цитохимическом тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) фагоцитами мышей и с помощью люминолзависимой хемилюминесценции [Зинкин В.Ю., 2004]

Уровень цитокинов (IL-1P, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-I2, IFN-y) в сыворотках животных определяли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), используя тест-системы фирмы «Biosource» (Бельгия)

Экспериментальный дисбиоз моделировали на белых беспородных мышах массой 14-16 г, у которых с помощью антибиотика доксициклина гидрохлорида (ОАО «Белмедпрепараты») проводили деконтаминацию нормальной микрофлоры или селективную деконтаминацию условно патогенной пристеночной микрофлоры толстой кишки с помощью фторхинолонового препарата ципрофлоксацина (цифрана, Reddy"s Lab., Индия).

Исследования просветной и пристеночной микрофлоры выполняли, анализируя асептически взятые у мышей фекальные массы и участки толстой кишки [Зуденков А.Е., 2001; Воробьев А.А., 2001,2003].

Для определения адгезивной активности энтероцитов применяли метод «перчатки» в модификации и подсчитывали средний показатель адгезии (СПА) [Горская Н.М., 1994, Брилис В.И., 1982, 1990]

Плазмидный анализ ДНК осуществляли, используя стандартную процедуру, предназначенную для очистки плазмидной ДНК с использованием щелочного лизиса [Остерман Л Д, 1981; Маниатис Т. и др., 1984].

Оценку ростовых свойств питательных сред при культивировании проводили с помощью Автоматизированного рабочего места микробиолога и химиотерапевта «Микроб-Автомат» на базе планшетного фотометра "Multiskan-Ascent" (Termo-Labsystems, Финляндия), оборудованного термостатом и встряхивателем Статистические методы

Статистическую обработку результатов проводили по общепринятым методикам (Ашмарин И П, Воробьев А.А., 1962) Результаты считали достоверными при р<0,05. Достоверность различий между средними значениями (X) экспериментальных данных оценивали по критерию Стьюдента

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ На ранних этапах работы выделены 15 культур бактерий. Выявлено, что только 3 штамма не обладали гемолитической и лецитиназной активностью (факторами па-тогенности), поэтому они выбраны для дальнейшего изучения.

Микроскопическое исследование мазков показало, что штаммы грамположи-тельны, характеризуются парацентральным и центральным расположением эндоспор.

При изучении культур на агаризованной модифицированной среде Гаузе №2 обнаружено три варианта колоний, характерных для

Все штаммы обладали морфологическими и физиолого-биохимическими свойствами типичными для представителей Бактерии были подвижны, росли на среде в присутствии 7% NaCl, характеризовались набором различных ферментов, расщепляющих такие субстраты, как: глюкоза, сахароза, мальтоза, ксилоза, эскулин, желатин, крахмал, казеин, редуцировали нитраты, не образовывали сероводород

Известно, что культуры В subtilis обладают выраженными антагонистическими свойствами в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов. В нашей работе это свойство оценивали с помощью метода отсроченного антагонизма, используя штаммы тест - культур из коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича (табл 1).

Таблица 1. Антагонистическая активность штаммов Bacillus subtilis

Зоны задержки роста тест-штаммов (мм) _iX±m)___

Исследуемые штаммы B.subtilis о г- yi г-fi f) С й ^ aureus FDA 209Р S aureus 29213 f, сч Tf ГЧ £ a о a 0 в s s 1 S I X. aureus «Филлииов» а гч 1 Г» с <3 о чО "о ГЧ Г4 О С (N 00 оо гц Гч| M1 "nJ

г- О <Л _ VI m IT) (N о п ГЧ гч +1 fl

№ 1719 N + г- Г4 f, +1 f! +i

in О VI О f о оо _ о о О

№ 1594 <Ч| CJ +1 +1 «-I С сч; п!

О О О О о 00 ft 00 о

№ 1318 Ni г", +1" +1 о! с> !Nj еч fl +1 О fj +1 fi + m + i + о + Г> f + о ГЧ + О CN ГЧ* +1 О + гч гч f. +1 (N

Полученные данные свидетельствовали, что уровень антагонистической активности штаммов отличался в зависимости от используемого тест - штамма. Все три штамма обладали выраженной антагонистической активностью в отношении двух видов шигелл (Sflexncri 337 и s.sonnei 170), S.aureus FDA 209P, S. aureus «Никифоров», P.mirabilis 24a, P.vulgans 177, C.albicans 690, E.coli 1882, P.aeruginosa 9022 и E.coh 212 (O157:H7), причем наибольшие показатели выявлены у штамма B.subtilis 1719, который проявлял антагонизм также против S.aureus 29213, S.aureus 25423.

Необходимо особо отметить, что изучаемые штаммы проявляли достаточно выраженный антагонизм в отношении энтеропатогенного штамма E.coli 212 (0157:Н7), способного синтезировать шигаподобный токсин (цитоверотоксин), причем максимальной активностью (30+2,0) мм обладал штамм B.subtilis № 1719.

Три оригинальных штамма В subtilis изучены на способность к адгезии, которая является одним из наиболее важных свойств пробиотических культур (табл. 2).

Таблица 2. Адгезивная активность штаммов Bacillus subtilis.

Исследуемые штаммы Адгезивная активность

Индекс адгезии микроорганизма (ИАМ) (Х±ш) Уровень адгезии

В. subtilis 1719 1,53+0,08 Низкий

В. subtilis 1594 2,84±0,47 Средний

В. subtilis 1318 3,08±0,33 Средний

Выявлено, что штамм B.subtilis 1719 обладал низкой, а штаммы B.subtilis 1594 и 1318 средней адгезивной активностью.

Антибиотикоустойчивость штамма, кандидата в препараты-пробиотики, является также важным свойством, определяющим возможность его применения совместно с антибактериальными препаратами. В связи с этим, проведено изучение антибиотико-резистентности штаммов B.subtilis к 14 антибиотикам, наиболее часто применяемым в клинике. Штамм B.subtilis 1719 оказался устойчив к гентамицину, полимиксину и эритромицину, а штаммы B.subtilis 1594 и B.subtilis 1318 резистентны только к гентамицину.

Представляло интерес выяснить, связана ли устойчивость к антибиотикам с хромосомной локализацией генетического детерминанта этого признака, или с наличием плазм ид.

Анализ плазмидного носительства штаммами B.subtilis мог предоставить информацию о природе антибиотикоустойчивости. В 0,9 % агарозном геле после проведения электрофореза в ряде анализируемых образцов ДНК (трек 2, 4 и 6) была идентифицирована фракция, совпадающая по размера с плазмидной ДНК (рис.1). Однако характер распределения этих брендов в агарозном геле отличатся от таковых контрольной плазмидной ДНК.

Для того, чтобы окончательно выяснить, являлась ли полученная ДНК плаз-мидной или это были хромосомные фрагменты, выделенный материал обработали мелкощепящими эндонуклеазами второго типа (рестриктазой Pst I). При анализе продуктов рестрикции в агарозном геле (рис. 1) низкомолекулярная фракция ДНК, выде-

ленная из изучаемых штаммов, распадалась без образования четких фрагментов, что свидетельствовало об отсутствии в образцах молекул плазмидной ДНК

Рис. 1. Данные электрофореза препаратов ДНК, выделенных из штаммов

Расшифровка обозначении

По-видимому, выявленная антибиотикоустойчивость, относится к природной устойчивости и, вероятно, контролир) ется генами, локализованными на хромосоме

В опытах in vivo штамм В subtilis 1719 оказался нетоксичным, нетоксигенным, авирулентным

Введение мышам (массой 14-16 г) антибиотика доксициклина гидрохлорида в дозе 5мг позволило создать модель дисбиоза, при которой происходила контаминация кишечника животных условно патогенной и патогенной микрофлорой

Введение культуры В subtilis 1719 в дозе 0,5x10% 1,0х109 м к /мышь в течение 7 дней, способствовало нормализации состава и численности просветной и присте-

№1 №2 №3 №4 №5 №6 №7 №8 №9 № 10 №11

маркер процесса

нативная ДНК штамма В ¡ыЫ1Ш 1719 расщепленная ДНК штамма В зыЫШз 1719 нативная ДНК штамма В ¡ыЫ1Ш 1594 расщепленная ДНК штамма В зыЫПк 1594 нативная ДНК штамма В ¡ыЫ1Ш 1318 расщепленная ДНК штамма В 8ыЬШ{8 1318 нативная ДНК штамма В 8ыЫШ 534 расщепленная ДНК штамма В 8ыЬйШ 534 нативная плазмида

расщепленная плазмида рРЕТпБ^ет

ночной микрофлоры, а также элиминации условно патогенных микроорганизмов (табл.3).

Таблица 3. Микрофлора у мышей при экспериментальном дисбиозе и после коррекции культурой Б.тЬиШ (Bs) 1719 в различных дозировках

Г Показатель Ig количества КОЕ/мл у мышей (1г фека ЛИЙ 11

1см кишки) (Х±т)

Контрольные (интакт-ные) После введения После лечения Bs в дозе (микробных клеток)

доксициклнна 0,5x10" 1,0хЮ9

Микроорганизмы я а Пристеночный слой КИШКИ я а о i Пристеночный слой кишки ч я "X Пристеночный слой кишки Я * s s = S с 5 H

е е е & S « ! s g a 3 С

Е. coli: 7+0,42 7+0.7 7.3+0.64 6,5+1.4 710,7 6.5+0.48 811.4 5+0.43

1ас\ % 94 100 64 84 100 100 100 mo

lac, % Ь 0 36 16 * 0 0 0 0

гемолизирующие 0 0 0 0 0 0 0 0 1

Р. vulgaris 0 0 710.26* 0 0 0 * 0 0

P. mirabilis * (1 0 6±0.42* 4.3Й.7* 0* * 0 0 0

С. freundii 610.42* 0 0 0 0 0 0 0

Enterococcus spp. 7±<).21 7+0.64 6±0,59 5.5Ю.84 7±0,42 5.5+0.84 710.48 510.47

S. epidermidis о 0 0 0 0 0 0 0

S. aureus 5±0.21 0 4±1.2* 4+0.21* * 0 0 * 0 » II

Staphylococcus spp. 4+0.43* * 0 0 410,48* 0 0 0 «

Candida spp. 6i0.64 0 4,5±0.21 6+0.92* * 0 * 0 1 0* 0

Lactobacillus spp. ¡9,510,42 7,610.43 1 5.510.4* 1 4+0.23* 910,44 7+0.34 1 910.21 7.5+0,84

1 Bifidobacterium spp. 2±0.1 2±0.1 1 2+0.1 2+0,1 1 2+0.1 2+0.1 2Ю.1 I 210,1

Clostridium spp. 5±0,22 3.1±0.21 1 510.21 4.5+0.24 1 5+0.59 1 4,510,73 1 5М.21 1 4.65+0.24

Примечание: * р<0,05

Подобные результаты получены при селективной деконтаминации условно патогенной пристеночной микрофлоры толстой кишки беспородных мышей с помощью фторхинолонового препарата ципрофлоксацина, сохраняющего численность бифидо-и лактобактерий . Культура В. subnhs 1719,

введенная в аналогичных дозах, приводила к существенном) снижению количества стафилококков (в 8,3 раза) по сравнению с контрольной группой животных, не получавших пробиотическую культуру Введение цифрана животным приводило к резкому изменению соотношения 1ас71ас: бактерий, а введение культуры В ^иЬ1}11\ 1719 изменяло это соотношение до уровня интактных мышей

На следующем этапе изучено влияние культуры В яиЪШа 1719 на адгезивную способность клеток эпитепия кишечника (энтероцитов) при экспериментальном дис-биозе, индуцированном ведением антибиотика доксициклина гидрохлорида

Обозначение групп мышей:

Группы мышей

О Чистые в

начале опыта О Доксициклин

Ш Доксициклин

без аечения В Доксициклин + В вцЫи 0,5 0 Доксицикпин ч-ВвцЫи 1,0 □ Чистые +

В виЬЫк 0,5 ■ Чистые +

В. эиЫИЬ 0,5Х109мк В йиЫШи 1,0 х ] О"м к

Рис. 2. Средний показатель адгезии (СПА) тест-штамма 8.ху1оэк 25 на эн-тероцитах на модели экспериментального дисбиоза и при его коррекции культурой В. suЪtilis 1719.

При коррекции дисбиоза культурой В 8иЪНШ 1719 в различных дозах наблюдалось снижение способности энтероцитов к адгезии (рис 2)

В серии экспериментов по изучению влияния штамма В яиЪШи! 1719 на некоторые иммунологические показатели выявлена способность этих бацилл достоверно

изменять метаболическую активность нейтрофтов по показателям НСТ-теста (рис 3)

Группы животных

Рис. 3. Влияние культуры В SllbtlllS 1719 на активность нейтрофилов (НСТ -тест) при экспериментальном дисбиозе

С помощью метода люминолзависимой хемилюминесценции получены аналогичные результаты по функциональной активности нейтрофилов

Наибольшее повышение его уровня происходило в период максимального проявления дисбиоза, индуцированного введением доксициклина

Под действием К)ЛЬТ)ры В subilla 1719 происходите уменьшение продукции

IФНО-а Введение культуры интактным животным не влияло на уровень продукции

Доксициклин

Группы мышей

Рис. 4. Изучение влияния культуры Б.шЫ1Ш 1719 на уровень продукции фактора некроза опухоли а (ФНО-а) при экспериментальном дисбиозе

Определение накопления цитокинов (1Ь-1Р, 1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-6, [Ь-10, 1И2, 1РЫ-у)

в динамике в сыворотках крови мышей после однократного введения культуры В^цЫНю 1719 выявило следующие закономерности.

В первые 12 ч после введения бактериальной культуры изменений в уровне цитокинов не происходило, за исключением 1Ь-1(5. Содержание других изученных цитокинов по сравнению с интактными животными значительно возросло только к 24 ч: И-1Р (в 13,7 раза) и И-4 (в 14, 6 раза). 1Ь-2 (в 5,2 раза), 1Ь-6 (в 7 раза), 1Ы0 (в1,5 раза), 1Ы2 (в 5,2 раза), 1РИ-у (в 9,7 раза).

При производстве препаратов-пробиотиков важным технологическим показателем является выход биомассы при культивировании микроорганизмов. Этот показатель напрямую зависит от ростовых свойств используемых питательных сред. Нами

изучены основные характеристики процессов культивирования Б^иЪйШ 1719 на семи питательных средах различного состава.

Полученные данные представлены в табл.4. Среды №5, СПАС-6 и картофельно-глицериновая среда обеспечивали рост штамма с показателем оптической плотности

(ОП), равным 0,24±0,01 (и=0,03 ч"1), 0,22+0,01 (иККОЗЗч1) и 0,3+0,01 (и=0,025 ч"1) соответственно. На средах СПАС-2, СПАС-4, №9 максимальная величина ОП составляла 0,42+0,03 (и=0,067 ч"1), 0,38+0,02 (и=0,05ч"") и 0,58+0,03 (и=0,037 ч"1) соответственно, а на среде ВК-2 - 0,85±0,6 (и=0,068ч""). Время достижения

максимальной концентрации биомассы на этих средах варьировало в пределах от

9±0,7 ч (СПАС-2) до 18±1,3 ч (КГГ).

Таблица 4. Накопление биомассы штаммов В. ниЬйНн 1719 на средах различного состава в процессе культивирования в течение 20 ч (Х±т)

Среда Среднее время ^-фазы (ч) Длительность экспоненциал ьной фазы (ч) Время достижения тах-концентрации биомассы (ч) Максимальн ый выход биомассы (оптич. плот.) Скорость роста (и)

№5 2 8+0,67 13±1,05 0,24+0,01 0,03

№9 2 11 ±0,8 13+0,99 0,5810,03 0,037

КГГ 2 2±0,12 18+1,3 0,3+0,01 0,025

СПАС-2 2 4+0,36 9±0,7 0,42+0,03 0,067

СПАС-4 2 4±0,34 11+1,1 0,38±0,02 0,05

СПАС-6 1,5 3+0,23 18+1,6 0,22±0,01 0,033

ВК-2 1,5 8±0,72 14±1,0 0,85+0,6 0,068

Максимальный выход биомассы (ОП) выявлен на среде ВК-2, при скорости роста а наименьший на среде СПАС-6 со скоростью роста

Известно, что наиболее часто в качестве источника углеводов в средах для культивирования используются глюкоза, мальтоза, сахароза, лактоза. В наших экспериментах, высокий выход биомассы получен на среде ВК-2 с добавлением глюкозы или сахарозы, показатели ОП соответствовали и

При использовании мальтозы наибольшая ОП зафиксирована на

среде №9 0,695±0,025 (и=0,058 ч "), тем не менее, она оказалась ниже показателей, полученных на среде ВК-2 с включением в качестве источников углеводов лактозы, сахарозы, глюкозы.

Установлено, что состав питательных сред не оказывал какого-либо влияния на антагонистические свойства штамма.

На следующем этапе оценены условия стабилизации жизнеспособности и антагонистических свойств штамма В. ¡ыЫШя 1719 при хранении в лиофилизированном и жидком состоянии при температуре 5±3 °С (табл. 5).

В лиофилизированном состоянии с сахарозо-желтиновым стабилизатором культура ВлыЬШй 1719 сохраняла жизнеспособность и антагонистические свойства не менее 4 лет (срок наблюдения). В табл. 5 представлены также результаты изучения свойств культур, хранившихся в течение 3 лет в жидком виде с добавлением различных стабилизаторов.

Таблица 5. Жизнеспособность клеток штамма В. тЬНШ 1719 при хранении в присутствии различных стабилизаторов

Из данных табл 5 следует, что оптимальным жидким стабилизатором является 7% раствор NaCl, который позволяет сохранять жизнеспособность штамма 1719 в течение 2 лет Для сохранения свойств культуры в течение 1 года возможно также использование дистиллированной воды и 10% раствора глицерина

При хранении в присутствии различных стабилизаторов не происходило статистически значимых изменений антагонистических свойств штамма В subtihs 1719

Сравнительный анализ штамма 1719 по антагонистическим и адгезив-

ным свойствам с коммерческими пробиотических препаратов Споробак-

терин, Россия (В subtihs 534), Цереобиоген, Китай (В cereus DM423), Субтил, Вьетнам (Biemis var vietnamí), Бактисубтил, Франция (В cereus IP5832), Нутролин, Индия (В toagulans) (табл 6), позволил получить следующие результаты

Наибольший уровень антагонистической активности В subi/lis 1719 проявлялся в отношении штаммов S flex neri 337 (30±3,0), S aureus «Никифоров» (30+2,5), P uilgam 177 (30±2,0) P aeruginosa 9022 (27±1,5) и E coli 212 (0157 H7) (30±1,5) Несколько слабее антагонизм выявлен у этого штамма с тест-культурами Ecoh 1882 (26±1,2), Saw eus 25423 (21±1,5), S sonnet 170 (20±2,0), 5 aureus «Филлипов» (20±1,5),

Менее значительная задержка роста выявлена в отношении тест-культур Saurem FDA 209Р (15±1,5), S aureus 29213 (15±3,0), P mirabilis 24a (12±1,2)

Среди изученных пробиотических культур наиболее близким, но уступающим штамму 1719 по антагонистической активности, оказался штамм

534 "Индийский*" штамм В coagulant, оказался слабым антагонистом, уступая по этому признаку всем использованным в опыте штаммам

Сравнение адгезивных свойств показало, что, в основном, штаммы коммерческих препаратов имели средний уровень адгезии, при этом ИАМ колебался от 3,08 до 3,8 кроме ""индийского" штамма (ИАМ=5,36±0,56 У штамма В subtllis 1719 этот показатель оказался самым низким (ИАМ=1,53±0,08)

Таблица 6. Сравнительная характеристика антагонистической активности штамма В. тЬНШ 1719 и культур коммерческих препаратов-пробиотиков в опы-

Зоны задержки роста тест-штаммов (мм) (Х+т)

Исследуемые штаммы Bacillus о Г-- vi Pi с, 3 s н yi с. о сч < с bu S ГЛ (Ч О сч 5 Vi S.aureus 25423 Л", aureus «Никифоров» S 0 5 <=; s 1 ÍÜ 5 1". пи rabil is 24а 0 г-- ¡с 1 о W4 о 3 о сч (Ч о ^ 5 § ^ сч ОС оо "с го ^ г» ■П" о сч Ñ

В. subtihs №1719 Г-(см" +1 N о со +1 о ГЛ щ +i т (Ч +i n 1П (N +1 о f, in +i С СЧ СЧ +¡ so in + Pó о, сч" +1 in сч in +i Г-- (N +Í vo п о Сч" + о с.

В.subtihs 534 Споробактерин (Россия) (-; СЧ +1 CS о +1 о СЧ О ГЛ +1 О го +1 го о. +1 00 +i СЧ (Ч

В. cereus DM423 Цереобиоген (Китай) СЧ +i ч- (N о о <4 О +1 о СЧ +1 <4 in +1 О о (Чг +1 о о о о о с +1

В. cereus var. vietnamí Субтил(Вьетнам) 1П + О о <4 + СЧ О о + (N о" +1 СЧ О, +i О о о + CI + о о О о о

В. cereus IP 5832 Бактисубтил (Франция) Ш оо + in о О г- + о +1 (N in +i in о CN + г"- ■ч- + т о + г" о о о о + г ■п +¡ о

В. coagulans Нутролин (Индия) с о О о + СЧ "Í. О +1 п СЧ o" -H (N О + о о о о о о

Таким образом, выделенный нами штамм В.ъиЫк 1719 по изученным свойствам имел качественные преимущества перед другими испытанными культурами коммерческих препаратов, что позволяет считать его перспективным в использовании для разработки нового пробиотического препарата.

1. На основании морфологических и физиолого-биохимических свойств выделенные штаммы идентифицированы как В ЯиЫйм. В препаратах ДНК штаммов В.тЫ/Ьх плазмид не обнаружено, что, по-видимому, указывает на хромосомный контроль ан-тибиотикорезистентности.

2. На модели дисбиоза белых мышей показана пробиотическая активность штамма В.зыЫШ 1719, проявляющаяся в элиминации условно-патогенных и патогенных микроорганизмов с восстановлением качественного и количественного состава нормальной микрофлоры.

3. Оптимальной средой для накопления биомассы при культивировании штамма

1719 является среда ВК-2 с добавлением в качестве источника углеводов глюкозы или сахарозы.

4. Установлено, что штамм В.яыЫШя 1719 сохраняет жизнеспособность и антагонистическую активность в лиофилизированном состоянии с сахарозо-желатиновым стабилизатором не менее 4 лет (срок наблюдения), в жидкой форме, стабилизированной 7% раствором №01 - 2 года, и 1 год в присутствии дистиллированной воды или 10% раствора глицерина.

5. Антагонистически активный, низкоадгезивный, бесплазмидный, нетоксичный штамм В.яыЫШя 1719, обладающий пробиотической и иммуномодулирующей активностью, депонирован в Государственной коллекции культур ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

6. Штамм В.зыЫШ 1719 (277) по биологическим свойствами и основным технологическим характеристикам перспективен для использования при разработке новых препаратов-пробиотиков.

1 Гатауллин А Г, Гайдеров А А Михайлова Н А, Осипова И Г, Романен-ко Э Е Биологические свойства штаммов ВааНиь sub tills различного происхождения Со «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дета в XXI веке» Пермь 2003, с 329-331

2 Гатауллин А Г, Михайтова Н А, Бтинкова Л П, Елкина С И, Горобец ОБ, Гайдеров А А, Калина НГ Изучение пристеночной микрофлоры кишечника мышей с использованием дифференциально-диагностических сред Сб «Разработка и стандартизация микробиологических питательных сред и тест-систем» Махачкала, 2003 с 48

3 Гатауллин А Г, Бтинкова Л П, Михайтова Н А, Елкина С И, Гайдеров А А, Калина Н Г, Горобец О Б Изменение состава пристеночной микрофлоры при экспериментальном дисбиозе как показатель влияния лечебных препаратов на макроорганизм Анапи Мечниывського шституту Харыв, 2003, №4-5, с 123-124

4 Михайлова Н А, Блинкова Л П, Елкина С И, Гатауллин А Г, Горобец О Б, Гайдеров А А, Калина Н Г Дисбиоз как интегральный показатель побочного действия препаратов Сообщение 1 Сб докладов «Функциональное питание, пищевая безопасность и здоровье людей в условиях мегаполиса» М,2003, с 38-39

5 Михайлова Н А, Блинкова Л П, Елкина С И, Гатауллин А Г, Горобец О Б, Гайдеров А А, Калина Н Г Дисбиоз как интегральный показатель побочного действия препаратов Сообщение 2 Материалы II Московского Международного Конгресса «Биотехнология состояние и перспективы развития» Москва, 2003, с 162

6 Гатауллин АГ, Блинкова ЛП, Михайлова НА, Елкина СИ, Гайдеров А А, Калина Н Г, Горобец О Б Изменение состава пристеночной микрофлоры как показатель эффективности применения лечебных препаратов при экспериментальном дисбиозе Анали Мечниывського шституту Харыв, 2004, №6, с 10-13

7 Гайдеров А А, Гатауллин А Г, Васильева Е А, Михайлова Н А, Осипова И Г Изучение воздействия препаратов пробиотиков на макрофагальное звено неспецифического иммунитета Сб материалов Международной конференции «Пробиоги-ки, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания Современное состояние и перспективы» М, 2004, с 21-22

8 Блинкова Л П, Михайлова Н А, Елкина С И, Гатауллин А Г, Калина Н Г, Токарская М М Влияние «Милайфа» и его сочетаний со споровым пробиотиком на резистентность белых мышей при экспериментальных инфекциях Сб материалов Между народной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные прод>кты питания Современное состояние и перспективы» М, 2004, с 4041

9 Блинкова Л П, Михайлова Н А, Шмыгалева Т П, Гатауллин А Г, Новиков В Ю, Шмыгал ев П А Адгезивные свойства клеток и спор В subtilis Сб материалов Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания Современное состояние и перспективы» М, 2004, с 41-42

10 Михайлова Н А, Годков М А, Гатауллин А Г, Зинкин Ю В, Ветошкин А И, Харитонова А В, Гайдеров А А Иммуномодмир\ющее влияние культуры В subtilis Сб материалов Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания Современное состояние и перспективы» М, 2004, с 204-205

11 Гатауллин А Г, Михайлова Н А, Блинкова Л П, Романенко Э Е, Елкина С И, Гайдеров А А, Калина Н Г Свойства выделенных штаммов Bacillus subtilis и их влияние на интестинальную микрофлору экспериментальных животных Ж мик-робиол, 2004, №2, с 91-94

12 Гатауллин АГ, Зинкин ЮВ, Ветошкин АИ, Годков МА, Гайдеров А А, Харитонова А В Изучение влияния препарата В subtilis при дисбиозе с помощью хемилюминесцентного анализа Сб материалов Международной конференции «8-ая Международная Путинская школа-конференция молодых ученых» Пущино, 2004,с 256

13 Блинкова Л П, Михайлова Н А, Горобец О Б, Елкина С И, Гатауллин А Г Калина Н Г, Гайдеров А А Экспериментальное изучение воздействия биологически активных препаратов на С albicans Успехи медицинской микологии, 2004, том III, с 48-49

14 Гатауллин А Г, Михайлова Н А, Хватов В Б, Блинкова Л П, Зинкин Ю В, Харитонова А В Применение хемилюминесцентного анализа для оценки анти-

бактериальной и антигрибковой активности препарата В subtil is. Успехи медицинской микологии, 2004, том III. с.50-51.

15. Михайлова НА., Блинкова Л П.. Гатауллин А.Г. Изучение параметров культивирования про биотических штаммов Bacillus subtihs на различных питательных средах. Материалы III Московского Международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 2005, с.124.

16. Гатауллин А.Г., Блинкова Л.П, Михайлова Н.А. Накопление биомассы пробиотических штаммов В.subtihs в питательных средах различного состава. Сб. материалов Всероссийской научной конференции с международным участием: «Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка, производство и применение» Уфа. 2005, ч 1.e. 134-136

Сдано в печать 19 мая 2005г. Объем печати 1 п.л. Заказ № 615. Тираж 100 экз. Отпечатано: ООО «Спринт-Принт» г. Москва, ул. Краснобогатырская, 92 тел.: 963-41-11, 964-31-39

-»« г.и» j » "-"Ж J

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Микробный антагонизм - основа создания биотерапевтических препаратов для коррекции дисбиотических состояний

Глава 2. Споровые пробиотики и их воздействие на макроорганизм

2.1. Препараты из бактерий рода Bacillus

2.2. Современные представления о механизмах лечебно-профилактического действия пробиотиков из бактерий рода Bacillus

2.3. Биологически активные вещества, продуцируемые аэробными спорообразующими бактериями

2.4. Факторы патогенности бактерий рода Bacillus 34 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 3. Объекты и методы исследований

3.1. Объекты исследований

3.2. Методы исследований 43 3.2.1. Оборудование и методики

Глава 4. Характеристика выделенных штаммов

4.1. Изучение морфологических и физиолого-биохимических свойств штаммов

4.2. Антагонистическая и адгезивная активность штаммов B.subtilis в опытах in vitro

4.3. Определение антибиотикоустойчивости и плазмидного профиля штаммов B.subtilis

Глава 5. Влияние штамма B.subtilis 1719 на макроорганизм

5.1. Изучение токсичности, токсигенности, вирулентности и пробиотической активности штамма B.subtilis 1719 в опытах in vivo

5.2. Изучение влияние штамма В.subtilis 1719 на показатели иммунитета в опытах in vivo при экспериментальном дисбиозе

Глава 6. Технологическая характеристика штамма B.subtilis 1719 как основы пробиотического препарата

6.1. Оценка ростовых свойств на различных жидких питательных средах

6.2. Изучение жизнеспособности и антагонистической активности штамма B.subtilis 1719 при хранении

Глава 7. Сравнительная характеристика свойств штамма B.subtilis\l\9 и штаммов, составляющих основу некоторых коммерческих препаратов-пробиотиков. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биологические свойства штаммов Bacillus subtilis, перспективных для создания новых пробиотиков"

Актуальность проблемы

На современном этапе в медицинской микробиологии появились новые данные, обосновывающие использование сапрофитной микрофлоры, которая способна в процессе своей жизнедеятельности вырабатывать биологически активные вещества (БАВ), подавляющие рост патогенных микроорганизмов, злокачественных опухолей и нормализующие различные патологические и биохимические процессы в организме человека .

В последнее десятилетие для профилактики и лечения заболеваний желу-дочно - кишечного тракта широко используют биопрепараты на основе живых микробных культур спорообразующих бактерий .

Бактерии рода Bacillus, одна из наиболее разнообразных и широко распространенных групп микроорганизмов, являются важными компонентами экзогенной флоры человека и животных .

Род Bacillus привлекает внимание исследователей с давних времен. Накопленные знания в области микробиологии, физиологии, биохимии, генетики бактерий свидетельствуют о преимуществах Bacillus как продуцентов биологически активных веществ: ферментов, антибиотиков, инсектицидов . Высокая приспособляемость к различным условиям существования (наличие или отсутствие кислорода, рост и развитие в значительном диапазоне температур, использование в качестве источников питания различных органических или неорганических соединений и т.д.) способствуют распространению бацилл в почве, воде, воздухе, пищевых продуктах и других объектах внешней среды, а также в организме человека и животных.

Разнообразие метаболических процессов, генетическая и биохимическая вариабельность, устойчивость к литическим и пищеварительным ферментам, послужили обоснованием использования бацилл в различных областях медицины. Управление по контролю за качеством продовольственных и лекарственных средств США, присвоило Bacillus subtilis статус GRAS (generally regarded as safe) - вполне безопасных организмов, что является обязательным условием для применения этих бактерий в производстве лекарственных препаратов .

Активность бацилл проявляется в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов. Благодаря синтезу разнообразных ферментов и других веществ они регулируют и стимулируют пищеварение, оказывают противоаллергенное и антитоксическое действие. При применении бацилл существенно повышается неспецифическая резистентность макроорганизма. Эти микроорганизмы технологичны в производстве, стабильны при хранении и, что существенно важно, экологически безопасны .

Лечебные и профилактические препараты на основе живых непатогенных микробов, способные оказывать при естественном способе введения благоприятные эффекты на физиологические и биохимические функции организма хозяина через оптимизацию его микробиологического статуса, относят в настоящее время к препаратам - пробиотикам .

Из бацилл наибольший интерес вызывают штаммы В. subtilis. По изученности генетических и физиологических свойств они занимают второе место после Е. coli. О больших возможностях В. subtilis в биотехнологии свидетельствует факт создания банка данных по молекулярной генетике этого штамма -SubtiList, в который вносится вся информация о бактериальном геноме .

На основе живых бактерий рода Bacillus, созданы препараты - пробиоти-ки, которые безвредны для макроорганизма, имеют широкий диапазон лечебно-профилактического действия и экологическую безопасность . Важное научно-практическое значение имеют результаты, посвященные использованию живых микробных культур рода Bacillus для лечения желудочно-кишечных заболеваний у человека и сельскохозяйственных животных .

В настоящее время в практическом здравоохранении широко используют известные препараты - пробиотики: бактисубтил, споробактерин, биоспорин, бактиспорин, субалин, цереобиоген, энтерогермин и другие .

Показания к лечебному применению и терапевтическая эффективность этих препаратов ограничивается свойствами штаммов, используемых для их производства. Определяющее значение при этом имеет спектр антагонистической активности против патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, являющихся причиной нарушения микроэкологии в различных биотопах организма человека или животных. Кроме того, нельзя не учитывать способности бацилл к продукции БАВ (полипептидные антибиотики, ферменты и др.) и их антибиотикорезистентности.

Многообразие и возникающая антибиотикоустойчивость микроорганизмов, участвующих в развитии дисбиотических нарушений, с одной стороны, а также вариабельность биосинтетических возможностей у разных штаммов B.subtilis, с другой, обуславливают целесообразность постоянного мониторинга штаммов, обладающих направленной пробиотической активностью и/или являющихся продуцентами различных БАВ.

Цель работы:

Изучить биологические свойства выделенных штаммов B.subtilis и оценить возможность их использования для разработки оригинального спорового пробиотика.

Задачи исследования:

1. Изучить морфологические, физиолого-биохимические, антагонистические, адгезивные и другие свойства выделенных культур B.subtilis в опытах in vitro и выбрать для дальнейших исследований наиболее перспективный штамм.

2. Оценить пробиотическую активность выбранного штамма B.subtilis в опытах in vivo.

3. Подобрать питательную среду, оптимальную для накопления биомассы изучаемого штамма B.subtilis.

4. Определить жизнеспособность и антагонистическую активность выбранного штамма B.subtilis при хранении.

5. Сравнить свойства оригинального штамма B.subtilis и культур, используемых для изготовления коммерческих препаратов-пробиотиков.

Научная новизна.

На основе изучения морфологических, физиолого-биохимических, генетических и других биологических свойств выделенных штаммов отобран бес-плазмидный штамм B.subtilis 1719, проявляющий антагонизм против условно патогенных и патогенных микроорганизмов различных таксономических групп, обладающий низкой адгезивной активностью, устойчивый к гентамицину, по-лимиксину и эритромицину.

Экспериментально обоснованы подходы к созданию производственной технологии, включающие изучение ростовых свойств штамма В.subtilis 1719 на оригинальных питательных средах, условий стабилизации его жизнеспособности и антагонистической активности как этапов получения нового препарата-пробиотика.

Подана заявка на изобретение (№2005111301 от 19.04.2005 г.): «Штамм бактерий Bacillus subtilis 1719 - продуцент антагонистически активной биомассы в отношении болезнетворных микроорганизмов, а также протеолитических, амилолитических и липолитических ферментов».

Практическая значимость.

Выделенный и идентифицированный штамм B.subtilis 1719 депонирован в Государственной коллекции культур ГИСК им. JI.A. Тарасевича под №277 и может быть рекомендован для разработки промышленной технологии получения оригинального биотерапевтического препарата-пробиотика.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Выделенные три штамма бактериальных культур по морфологическим, физиолого-биохимическим и другим свойствам соответствуют виду В. subtilis. Они не содержат плазмид, антагонистически активны в отношении условно патогенных и патогенных бактерий разных таксономических групп, имеют низкий или средний уровень адгезии.

2. Штамм B.subtilis 1719 обладает пробиотическими свойствами, проявляющимися в элиминации условно патогенных и патогенных микроорганизмов с восстановлением количественного и качественного состава нормальной микрофлоры при экспериментальном дисбиозе, а также оказывает иммуномодули-рующее действие на макроорганизм.

3. По технологическим характеристикам штамм B.subtilis 1719 можно рекомендовать в качестве кандидата для создания оригинального препарата-пробиотика.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Гатауллин, Айрат Гафуанович

1. На основании морфологических и физиолого-биохимических свойств выделенные штаммы идентифицированы как B.subtilis. В препаратах ДНК штаммов B.subtilis плазмид не обнаружено, что, по-видимому, указывает на хромосомный контроль антибиотикорезистентности.

2. На модели дисбиоза белых мышей показана пробиотическая активность штамма B.subtilis 1719, проявляющаяся в элиминации условно-патогенных и патогенных микроорганизмов с восстановлением качественного и количественного состава нормальной микрофлоры.

3. Оптимальной средой для накопления биомассы при культивировании штамма B.subtilis 1719 является среда ВК-2 с добавлением в качестве источника углеводов глюкозы или сахарозы.

4. Установлено, что штамм B.subtilis 1719 сохраняет жизнеспособность и антагонистическую активность в лиофилизированном состоянии с сахаро-зо-желатиновым стабилизатором не менее 4 лет (срок наблюдения), в жидкой форме, стабилизированной 7% раствором NaCl - 2 года, и 1 год в присутствии дистиллированной воды или 10% раствора глицерина.

5. Антагонистически активный, низкоадгезивный, бесплазмидный, нетоксичный штамм B.subtilis 1719, обладающий пробиотической и иммуно-модулирующей активностью, депонирован в Государственной коллекции культур ГИСК им. J1.A. Тарасевича.

6. Штамм B.subtilis 1719 (277) по биологическим свойствами и основным технологическим характеристикам перспективен для использования при разработке новых препаратов-пробиотиков.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Открытия и достижения современной биологической и медицинской науки позволили разработать и внедрить в практику новые биопрепараты - пробиотики. Основу этих лекарственных средств составляют живые микробные культуры. В основе лечебного действия этих препаратов лежит выраженный микробный антагонизм в отношении патогенных и условно патогенных штаммов - возбудителей болезней. В процессе лечения не менее важной является иммуномодулирующая активность пробиотиков. Неоспоримые преимущества препаратов из живых бактерий перед лекарствами, синтезированными химическим путем, это - безвредность, их физиологич-ность для организма человека, отсутствие аллергических реакций,. Уже сейчас пробиотики заняли лидирующие позиции при коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта, нарушениях обмена веществ, лечении последствий антибактериальной, химио-, гормональной и лучевой терапии. В ре зультате исследования феномена транслокации бактерий показано, что пробиотики могут с успехом заменять антибиотики и протеолитические ферменты при профилактике и лечении различных хирургических инфекций.

В последнее десятилетие для профилактики и лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта широко используют биопрепараты на основе живых микробных культур спорообразующих бактерий .

Разнообразие метаболических процессов, генетическая и биохимическая вариабельность, устойчивость к литическим и пищеварительным ферментам, послужили обоснованием использования бацилл в различных областях медицины. Эти микроорганизмы технологичны в производстве, стабиль> ны при хранении и, что существенно важно, экологически безопасны .

Высокая активность у штаммов против одного набора тест - культур не гарантирует его активности против других. В связи с этим использование спорового пробиотика ограничено конкретными лечебными целями. Вариабельность нозологических форм гнойно-септических заболеваний и многообразие этиологически значимых для развития дисбиотических нарушений микроорганизмов определяют требования к используемому биопрепарату. Это побуждает исследователей к постоянному скринингу штаммов-антагонистов с заданными свойствами.

Изученные нами штаммы обладали морфологическими и физиолого-биохимическими свойствами, типичными для представителей В. subtilis, и характеризовались набором ферментов, расщепляющих различные субстраты.

По данным литературы B.subtilis обладают выраженными антагонистическими свойствами в отношении широкого спектра патогенных микроорганизмов и высокой ферментативной активностью, за счет чего нормализуют процессы пищеварения, а также обеспечивают антитоксический и противоаллергический эффект .

Исследованные штаммы B.subtilis имели широкий спектр антагонистической активности, низкий (В. subtilis № 1719) или средний (В. subtilis № 1594, В. subtilis № 1318) уровень адгезии.

Таким образом, изученные нами штаммы характеризовались высокой пробиотической активностью. Однако изучение биохимических свойств показало, что штамм B.subtilis 1719 обладал более высокой ферментативной активностью (протеазной, амилазной, липазной), что выражалось в наибольшей зоне гидролиза исследуемых субстратов. Кроме того, низкий уровень адгезивной активности штамма В.subtilis 1719 и, по-видимому, его природная антибиотикоустойчивость, контролируемая хромосомой, позволили сделать заключение о перспективности дальнейшего изучения этой культуры.

На наш взгляд, перспективы для расширения промышленного выпуска препаратов на основе рода Bacillus очень велики.

Бациллы способны секретировать в культуральную жидкость множество ферментов. Они служат важным промышленным объектом для получения протеолитических и амилолитических ферментов, используемых для производства пищевых продуктов, детергентов и медико-биологических субстанций . В последнее десятилетие с их участием получен ряд новых антибиотиков, бактериальных инсектицидов и других биологически активных веществ .

Несмотря на то, что В. subtilis имеют статус GRAS, в литературе имеются единичные сообщения о наличии факторов патогенности, у некоторых штаммов В. subtilis. Указывается, что это не является постоянным признаком, поскольку исчезает при пересевах. Высказано предположение о взаимосвязи патогенных свойств бактерий с наличием у них плазмид. Например, Le Н. и Anagnostopoulos С. выделили плазмиды из 8 штаммов В. subtilis у 83 обследованных. Плазмидные ДНК были определены только в клетках токсигенных штаммов В. subtilis и не обнаружены в клетках других штаммов одного вида, не обладающих токсигенностью. Элиминация плазмид из токсигенных штаммов под воздействием элиминирующих агентов приводила к устранению токсигенных свойств фильтратов культур. Однако генетическая роль плазмид изучена недостаточно.

В проведенных нами исследованиях, в препаратах выделенной ДНК трех изученных штаммов В. subtilis плазмид не обнаружено.

Авторы, изучавшие воздействие бацилл на организм теплокровных, пришли к заключению, что штаммы В. subtilis совершенно безвредны для человека и животных. Доказательством безвредности для макроорганизма служат экспериментальные данные о том, что уже через несколько дней после парентерального введения, B.subtilis элиминируется из организма . Механизмы лечебного действия этих культур изучали на животных. В настоящее время считают, что терапевтический эффект споровых пробиотиков определяется комплексом факторов, в их числе: продуцирование культурами В. subtilis бактериоцинов, подавляющих рост патогенных и условно патогенных микроорганизмов; синтез высокоактивных ферментов: протеаз, рибонуклеаз, трансаминаз и др.; продуцирование субстанций, нейтрализующих бактериальные токсины.

Изучение свойств выбранного штамма на мышах показало, что он ави-рулентен, не обладает токсичностью и токсигенностью.

Факторами положительного воздействия пробиотиков на макроорганизм являются различные продукты микробного синтеза: аминокислоты, полипептидные антибиотики, гидролитические ферменты и ряд других биологически активных субстанций, имеющих меньшее значение. Поэтому изучение и выделение протективных субстанций, продуцируемых микроорганизмами рода Bacillus, и создание на их основе медико-биологических препаратов является насущной необходимостью .

В желудочно-кишечном тракте проявляется прямое антагонистическое действие бацилл, которое носит преимущественно избирательный характер в отношении патогенных и условно патогенных микроорганизмов. В то же время они характеризуются отсутствием антагонизма в отношении представителей нормальной микрофлоры.

В проведенных нами исследованиях при коррекции экспериментального дисбиоза, индуцированного введением антибиотика доксициклина, культура В. subtilis 1719 способствовала нормализации состава и численности кишечной микрофлоры, а также элиминации условно патогенных микроорганизмов в пристеночной и просветной микрофлоре.

Из литературных данных следует, что производственные штаммы рода Bacillus обладают низким индексом адгезивной активности к эритроцитам и слабой или средней адгезивностью к эпителиальным клеткам кишечника. Штаммы B.subtilis 534 и ЗН имеют больше адгезинов к рецепторам энтеро-цитов, штамм В. licheniformis - к колоноцитам, т.е. у разных штаммов по-видимому, имеются адгезины к рецепторам разных клеток кишечника .

Их активность осуществляется в просвете кишечника и направлена в отношении патогенных микроорганизмов, не оказывая антагонистического действия на представителей нормальной микрофлоры. При приеме споровых пробиотиков реализуется возможность восстановления аутофлоры в различных локусах кишечника, и через 3-5 суток количество лактобактерий, бифи-добактерий, кишечных палочек и др. увеличивается, а затем восстанавливается до нормальных показателей .

Результаты проведенных нами исследований по изучению адгезии микроорганизмов на энтероцитах, позволяют с большей вероятностью утверждать, что адгезивная способность клеток кишечника зависит от количественного и качественного состава нормальной микрофлоры. При дисбиоти-ческих состояниях происходит открытие рецепторов на поверхности энтероцитов, на которые прикрепляются условно патогенные и патогенные микроорганизмы, а при коррекции дисбиоза происходит колонизация кишечника нормальной микрофлорой и происходит уменьшение количества рецепторов энтероцитов, способных адгезировать на своей поверхности неиндигенные микроорганизмы.

Известно, что нормальная микрофлора играет важную пусковую роль в механизме формирования иммунитета и специфических защитных реакций в постнатальном развитии макроорганизма .

Роль микрофлоры в развитии иммунного ответа обусловлена ее универсальными иммуномодулирующими свойствами, которые включают им-муностимуляцию и иммуносупрессию. Установлено, что бактериальные ли-пополисахариды (ЛПС) оказывают иммунорегулирующее действие на Ig А -иммунный ответ и играют роль адъювантов. Микрофлора обеспечивает развитие комплекса неспецифических и специфических иммунологических реакций, формируя адаптационно-защитные механизмы .

Какой бы высокой антимикробной активностью не обладало лекарственное средство, решающая роль в ликвидации инфекционного патологиче ному статусу. Создание препаратов, эффективных по антимикробным показателям и стимулирующих реакции иммунитета, представляется важной задачей. Поэтому большое количество исследований направлено на изучение влияния препаратов - пробиотиков на разные звенья иммунной системы человека и животных.

Введение живых культур аэробных бацилл заметно стимулирует in vivo продукцию сывороточного интерферона и интерферона, индуцированного in vitro вирусом болезни Ньюкастла .

В ряде работ указывается на то, что препараты - пробиотики оказывают иммуномодулирующее действие, восстанавливая нарушенный патологией иммунный статус, увеличивая продукцию эндогенного интерферона, усиливая функциональную активность макрофагальных клеток, повышая фагоцитарную активность лейкоцитов крови - моноцитов и нейтрофилов .

Нашими исследованиями показано, что культура В. subtilis 1719 достоверно изменяла метаболическую активность нейтрофилов при коррекции дисбиоза и не вызывала изменений функциональной активности нейтрофилов при нормальном состоянии индигенной микрофлоры. Кроме того, установлено, что дисбиоз сопровождался повышением уровня ФНО-а, что свидетельствовало о выраженной фагоцитарной, цитотоксической, адгезивной активности макрофагов, лимфоцитов, а также клеток эндотелия и эпителия тонкой кишки.

Повышенная секреция провоспалительного цитокина у мышей с дис-биозом, вероятно, отражает активацию иммунокомпетентных клеток (Т-лимфоцитов, моноцитов/макрофагов). Под влиянием культуры B.subtilis 1719 * наблюдали снижение продукции ФНО-а. Введение культуры интактным животным, изменений уровня продукции ФНО-а не вызывало.

Учитывая, что ФНО-а является маркером воспалительных реакций, сделан вывод о важной роли пробиотика в повышении противовоспалительной активности иммунокомпетентных клеток у животных.

Проведенные исследования по изучению динамики продукции цитоки-нов под влиянием штамма B.subtilis 1719 показали, что культура не оказывала влияния на продукцию цитокинов в первые часы после введения, кроме IL-lp, количество которого накапливалось постепенно. Уровень других изученных цитокинов (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-y) значительно возрос в интервале от 12 до 24 ч.

Таким образом, модуляция клеток иммунной системы и изменение потенциала цитокинов может быть одним из механизмов, посредством которого культура В. subtilis 1719 способствует коррекции дисбиоза.

Анализ результатов научных исследований, проводимых у нас в стране и за рубежом, свидетельствует о масштабах использования бактерий рода Bacillus для получения продуктов из биомассы бактерий или их метаболитов. Известные способы культивирования бактерий рода Bacillus являются основой для технологии получения ряда бактериальных и ферментных препаратов. .

При изучении ростовых свойств культуры В. subtilis 1719 на различных жидких питательных средах, установлено, что для максимального накопления биомассы наиболее адекватным субстратом для культивирования штамма можно считать среду ВК-2 с добавлением глюкозы или сахарозы

В настоящее время при отборе и характеристике производственных культур микроорганизмов учитываются, главным образом, следующие показателя биологической характеристики: спектр и уровень антагонистической активности, технологичность, т.е. способность к быстрому накоплению био* массы, устойчивость к лиофильному высушиванию, жизнеспособность при хранении. Особое внимание уделяется критериям степени безопасности используемых микроорганизмов для здоровья человека .

В проведенных исследованиях по оценке жизнеспособности микробных клеток B.subtilis 1719 при хранении в присутствии жидких стабилизаторов выявлено, что оптимальным стабилизатором является 7% раствор NaCl, который позволял сохранять жизнеспособность и антагонистические свойства штамма в течение 2 лет. Для сохранения свойств культуры в течение 1,5 лет возможно использование 10% раствора глицерина, 1 года - дистиллированной воды, при этом установлено, что указанные наполнители, статистически значимых влияний на антагонистические свойства штамма B.subtilis 1719 не оказывали. Необходимо отметить, что важным фактом является способность штамма B.subtilis 1719 сохранять антагонистическую активность в отношении S.sonnei и S.aureus в жидких стабилизаторах длительный срок -36 мес. (срок наблюдения).

Лиофильное высушивание с сахарозо-желатиновым стабилизатором сохраняло жизнеспособность и антагонистическую активность штамма B.subtilis 1719 в течение 4 лет (срок наблюдения).

В настоящее время в практическом здравоохранении широко используют известные препараты - пробиотики: бактисубтил, споробактерин, биоспорин, бактиспорин, субалин, цереобиоген, энтерогермин и другие

Сравнительное изучение штамма B.subtilis 1719 по антагонистической и адгезивной активности с коммерческими культурами следующих пробиоти-ческих препаратов: Споробактерин, Россия (В. subtilis 534), Цереобиоген, Китай {В.cereus DM423), Субтил, Вьетнам {В.cereus var. vietnami), Бактисубтил, Франция (B.cereus IP5832), Нутролин, Индия (B.coagulans), показало, что выделенный штамм является оригинальным и может быть рекомендован в качестве производственного, при получении нового препарата-пробиотика.

Таким образом, по физиолого-биохимическим свойствам штамм B.subtilis 1719 имеет четко различимые индивидуальные признаки, занесенные в паспорт культуры при депонировании в коллекции культур ГИСК им. JI.A. Тарасевича. Кроме того, доминирующее положение выделенного штамма B.subtilis 1719 по антагонистической активности свидетельствует о перспективности использования этой культуры для разработки на его основе пробиотического препарата.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гатауллин, Айрат Гафуанович, Москва

1. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Медизд, 1962, 180 с

2. Байбаков В.И., Карих Т.Л., Борукаева Л.А. и др. Нормализация кишечной микрофлоры и общего состояния мышей линии JCR под влиянием концентрата бифидобактерий.//Антибиотики и химиотерапия. 1997. - Т. 42, №3. - С. 20-24.

3. Байда Г.Е., Бударина Ж.И. Первичная структура и анализ гена гемолизина II Bacillus cereus // 2 Откр. гор. науч. конф. мол. Ученых г. Пущино, 23-25 апр. 1997: Тез. докл. Пущино. - 1997 - С. 45-46.

4. Байда Г.Е., Кузьмин Н.П. Ген HLY-III Bacillus cereus, клонированный в Escherichia coli, кодирует новый поро-формирующий гемолизин // Междун. конф. посвящ. памяти акад. А.А.Баева: Тезисы докл., Москва, 20-22 мая 1996. М. - 1996. - С. 108, 291.

5. Барановский А.Ю., Кондрашина Э.А. Дисбактериоз и дисбиоз кишечни-ка//СПб. «Питер». -2000. -209 с.

6. Баханова Е.М., Николаев С.М., Николаева И.Г., и др. Раст. ресурсы. 2001 . Т. 37, вып. 1. С. 70-76. Влияние экстракта из побегов Pentaphylloides fruticosa на течение экспериментальных дисбактериозов кишечника, вызванных сульфадиметоксином и изониазидом

7. Белявская В.А., Сорокулова И.Б., Ильичев А.А. Перспективы конструирования иммунопрепаратов на основе рекомбинантных бацилл // Новые направления биотехнологий: Тез. док. YI Конф. РФ, 24-26 мая, 1994. Пущино. -1994.-С. 68.

8. Белявская В.А., Сорокулова И.Б., Масычева В.А. Рекомбинантные пробио-тики: проблемы и перспективы использования для медицины и ветеринарии // Дисбактериозы и эубиотики: Тезисы докладов Всеросссийской научно-практической конф. М. - 1996. - С. 7.

9. Белявская В.А., Чердынцева Н.В., Бондаренко В.М., и др. Биологические эффекты интерферона, продуцируемого рекомбинантными бактериями препарата пробиотика Субалина. Журн. микробиол., 2003, №2, с. 102-109.

10. Беляев Е.И. Пути усовершенствования препаратов, нормализующих микрофлору кишечника / Респ. сборник научных трудов: «Аутофлора человека в норме и патологии. Горький. - 1988. - С. 74-78.

11. Билибин А. Ф. //Тер. арх. -1967. № 11. - С. 21-28.

12. Билибин А. Ф. // Клин. Медицина. 1970. - № 2. - С. 7-12.

13. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам обследования. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. М.: Медицина, 1982. - С. 180.

14. Блинкова Л.П., Семенов С.А., Бутова Л.Г. и др. Антагонистическая активность свежевыделенных штаммов бактерий рода Bacillus // ЖМЭИ. 1994. -N5.-С. 71-72.

15. Бойко Н.В., Туряница А.И., Попович Е.П., Вьюницкая В.А. Антагонистическое действие культур Bacillus subtilis на бактерии рода Klebsiella / Микробиол. ж. 1989. - Т. 51, N 1. - С. 87-91.

16. Бойко Н.В., Лисецька М.В. Розробка пробютиюв виб1рковощн: Протискле-ромна ефектившсть деяких штам1в В. subtilis // Наук. вюн. Ужгор. ун-ту. Сер. Бюл. 1997. - N 4. - С. 194-198.

17. Бондаренко В.М., Петровская В.Г. Ранние этапы развития инфекционного процесса и двойственная роль нормальной микрофлоры // Вестник РАМН. -М.- 1997.-N3.-C. 7-10.

18. Бондаренко В.М., Чупринина Р.П., Аладышева Ж.И., Мацулевич Т.В. Пробиотики и механизмы их лечебного действия // Эксперим. и клин, гастроэн-терол. 2004. № 3. С. 83-87.

19. Бочкарева Н.Г., Белогорцев Ю.А., Удалова Э.В. и др. Штамм бактерий Bacillus subtilis продуцент комплекса гидролитических ферментов, обогащенных b-глюканазой // Пат. N 2046141 Россия, С12 N 9/42, Опубл. 20.10.95. - Бюл. N 29.

20. Брилис В.И. Адгезивные свойства лактобацилл //Автореф. дис. канд. мед. наук. Тарту. -1990. - 25 с.

21. Брилис В.И., Брилине Т.А., Ленцнер Х.П., Ленцнер А.А. Адгезивные и ге-магглютинирующие свойства лактобацилл. Журн. микробиол., 1982, 9: 7578.

22. Васильева В.Л., Тацкая В.Н., Резник С.Р. Опыт применения растительного и микробного адъювантов при получении иммунных асцитных жидкостей у лабораторных животных // Мжробюл. журн. 1974. Т. 36, N 3. - С. 358-360.

23. Вершигора A.E. Основы иммунологии // Киев: Вища школа. 1975. - 319 с.

24. Винник Ю.С., Перьянова О.П., Якимов С.В. и др., Метод лечения гнойных ран с использованием антагонистов / International journal on immunorehabilitation. 1998. - N 4., С. 143.

25. Виноградов Е.Я., Шичкина В.П. Штамм бактерии В. mucilaginosus в качестве продуцента биостимулятора неспецифического иммунитета у телят // А.с. 1210452, СССР -1/00. Опубл. 27.04.96. - Бюл. N 12.

26. Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П.Итоги науки и техники: Биофизика 1989; 24: 172.

27. Воробьев А.А., Абрамов Н.А., Бондаренко В.М., Шендеров Б.А. Дисбакте-риозы актуальная проблема медицины //Вестник АМН. -1997. - № 3. -С.3-9.

28. ВоробьевА.А., Несвижский Ю.В., Зуденкова А.Е., Буданова Е.В. Сравнительное изучение пристеночной и просветной микрофлоры толстой кишки в экспериментах на мышах. Журн. микробиол., 2001, 1: 62-67.

29. ВоробьевА.А., Несвижский Ю.В., Липницкий Е.М. и др. Исследование пристеночной микрофлоры кишечника человека. Журн. микробиол., 2003, 1: 6063.

30. Вьюницкая В.А., Бойко Н.В., Спивак Н.Я., Ганова Л.А./ Некоторые механизмы действия новых микробиотиков // Микробиологические и биотехнологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства: Сборник тезисов Алма-Ата, 1990. - С. 17.

31. Галаев Ю.В. Патогенные ферменты бактерий // М.: Медицина. 1968. - 115 с.

32. Гончарова Г.И., Семенова А.П., Лянная A.M., и др. Количественный уровень бифидофлоры в кишечнике и его коррелятивная связь с состоянием здоровья человека.// Антибиотики и микроэкология человека и животных. -1988.-С.118-123

33. Горская Е.М. Механизмы развития микроэкологических нарушений в кишечнике и новые подходы к их коррекции.//Диссертация в форме научного

34. Грачева Н.М., Гончарова Г.И. и др. Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение при дисбактериозе кишечника. Методические рекомендации. 1986, С. 23

35. Грачева Н.М., Гаврилов А.Ф., Аваков А.А. и др. - Новые лекарственные препараты. 1994, №1, С. 3-12

36. Грачева Н.М., Гаврилов А.Ф., Соловьева А.И. и др. Эффективность нового бактерийного препарата биоспорина при лечении острых кишечных инфекций // Журн. микробиол. 1996. - N 1. - С. 75-77.

37. Гребнева A.J1., Мягкова Л.П. Кишечный дисбактериоз//Руководство по гастроэнтерологии в 3 т. М., 1996. -Т.З. -С.324-334

38. Григорьева Т.М., Кузнецова Н.И., Шагов Е.М. Штамм Bacillus thuringiensis 4КН, синтезирующий экзотоксин со специфической активностью против колорадского жука// Биотехнология. 1994. - N 9-10. - С. 7-10.

39. Гулько М.А., Казаринова JI.A., Позднякова Т.М. Способ получения инозина // Пат. N 175583, С12Р 19/32. Опубл. 30.08.94. - Бюл. N 16.

40. Демьянов А.В., Котов А.Ю., Симбирцев А.С., Диагностическая ценность исследования уровней цитокинов в клинической практике. Журнал Цитоки-ны и воспаление, 2003, Т. 2, № 3, с. 20-35

41. Егоров Н.С., Зарубина А.П., Выборных С.Н., Ландау Н.С. Синтетическая * среда для выращивания бактерий рода Bacillus // Вестник МГУ. 1989. N 4.1. С. 52.

42. Ермакова Л.М., Смирнова Т.А., Алиханян С.И. и др., Кристаллические включения у мутанта Bacillus subtilis с измененным спектром протеиназ // Докл. АН СССР. 1977. - Т. 236, N 4. - С. 1001-1003.

43. Жирков И.Н., Братухин И.И. Применение пробиотика РАС для коррекции дисбактериозов у телят// Ветеринария. 1999. N 4. - С. 40-42.

44. Згонник В.В., Фуртат И.М., Василевская И.А. и др. Антагонистические свойства спорообразующих бактерий, контаминирующих процесс производства лизина//Микробиол. ж. 1993. -Т.55, N4. - С. 53-58.

45. Зинкин В.Ю. Фотометрический НСТ-тест с нейтрофилами крови человека и его клинико-иммунологическая значимость у больных с травмой опорно-двигательного аппарата. Автореф. дис. канд. мед. наук.- Москва, 2004.

46. Зуденков А.Е. Микрофлора и состав иммунокомпетентных клеток пристеночного муцина толстой кишки в норме и при некоторых патологических состояниях. Автореф. дис. канд. мед. наук,- Москва, 2001.

47. Ивановский А.А., Новый пробиотик бактоцеллолактин при различных патологиях у животных // Ветеринария. 1996 - N11. - С. 34-35.

48. Ивановский А.А., Вепрева Н.С., Зимирева В.В., Лагунова О.П. Способ получения пробиотика для ветеринарии / RU Патент N 2084233, опубл. 20.07.97. Бюл. N 20.

49. Кандыбин Н.В., Ермолова В.П., Смирнов О.В. Итоги и перспективы применения бактокулицида // Совр. достиж. биотехнол.: Матер. 1 Конф. Сев.-Кавк. региона, Ставрополь, сент. 1995. Ставрополь. - 1995. - С. 14-15.

50. Каширская Н.Ю. Значение пробиотиков и пребиотиков в регуляции кишечной микрофлоры.//Русский медицинский журнал. 2000. - Т. 8, №13-14. - С. 572-575.

51. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Рубакова Э.И. Система цитокинов. М., 2000.

52. Козачко И.А., Вьюницкая В.А., Бережнизкая Т.Г. и др. Бактерии рода 4 Bacillus перспективные культуры для создания биологических средств защиты растений от болезней.// Мшробюл. ж. - 1995.- Т.57, N 5. - С. 69-78.

53. Красноголовец В.Н. Дисбактериоз кишечника. М., 1979. -198 с.

54. Кудрявцев В.А.,Сафронова JI.A., Осадчая А.И. и др. Влияние живых культур Bacillus subtilis на неспецифическую резистентность организма // Мик-робиол. ж. 1996 - Т.58, N 2. - С. 46-53.

55. Кузнецова Н.И., Смирнова Т.А., Шамшина Т.Н. и др. Штамм Bacillus thuringiensis, токсичный для комнатной мухи // Биотехнология. 1995. -N3-4.-С. 11-14.

56. Лапчинская А.В., Шендеров Б.А. Коррекция дисбактериозов, вызванных цефалексином, некоторыми иммуномодуляторами.//Медицинские аспекты микробной экологии. М., 1991. -С.70-79

57. Ленцнер А.А., Ленцнер Х.Т., Микельсаар М.Э. с соавт. Лактофлора и колонизационная резистентность.//Антибиотики и мед. биотехнология. -1987. -32. -№3. -С. 173-180.

58. Лещенко В.М. Клиника, диагностика и лечение висцерального кандидамикоза. Методические рекомендации. М., 19871.

59. Лисецька М.В. Експериментальне визначення антагонютичжм активносп штам1в Bacillus subtilis щодо Klebsiella rhinoscleromatis // Наук. вюн. Ужгор. ун-ту. Сер. Бюл. 1997. - N 4. - С. 207-212

60. Лопатина Т.К. с соавт. Иммуномодулирующее действие препаратов* эубиотиков //Вестник РАМН. М., «Медицина». -1997. №3. -С.30-34

61. Лукин А.А. Антибиотикообразование и споруляция у плазмидных и бес-плазмидных микроорганизмов // Пущино. 1978. - С. 25-28.

62. Мазанкова JI.H., Михайлова Н.А., Курохтина И.С. и др. Бактиспорин новый пробиотик для лечения острых кишечных инфекций у детей// Человек и лекарство: Тез. докл. V Российского Национального Конгресса, Москва, 8-12 апреля 1997г. - М. - С. 199.

63. Мазанкова Л.Н., Ваулина О.В. Новые лекарственные средства для коррекции дисбиотических нарушений.//Детский доктор. 2000. №3. - С. 51-53.

64. Маниатис Т., Френч Э., Сэмбрук Дж. Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование, 1984.

65. Марков И.И., Жданов И.П., Марков А.И. Штамм Bacillus subtilis МЖ-6 антагонист микобактерий туберкулеза // Пат. N 2120992, С 12N 1/20. - Опубл. 27.10.98.-Бюл.N30.

68. Микшис Н.И., Шевченко О.В., Еремин С.А. и др., Популяционная гетерогенность штаммов Bacillus anthracis II Деп. в ВИНИТИ 04.06.98. Саратов. -1998.-7 с.

69. Митрохин С.Д. // Антибиотики и химиотерапия. 1991. - № 8. - С.46 - 50.

70. Митрохин С.Д. Метаболиты нормальной микрофлоры человека в экспресс-диагностике и контроле лечения дисбиоза толстой кишки: Автореферат дис. д-ра мед. наук, М., 1998. 37 с.

71. Митрохин С.Д., Ардатская М.Д., Никушкин Е.В., Иваников И.О. и др. - М., 1997. 45 с. Комплексная диагностика, лечение и профилактика дисбакте-риоза (дисбиоза) кишечника в клинике внутренних болезней (Методические рекомендации).

72. Митрохин С.Д., Шендеров Б.А.Микробиологические и биохимические показатели изменения микробной экологии толстой кишки крыс под влиянием рифампицина. Антибиотики и химиотерапия - 1999, Т. 34 № 6 (482-4).

73. Молчанов O.JL, Позняк A.JI. Применение биоспорина в комплексной терапии бактериального вагиноза // Тез. докл: Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней. Санкт-П. - 1999 г. С. 187.

74. Музыченко JI.A., Сенаторова В.Н., Альховская JI.JI. и др. Морфометрический анализ развития микроорганизмов / Биотехнология. 1990. - N 3. - С. 3-6.

75. Мюллер Г., Литц П., Мюнх Г. Микробиология пищевых продуктов растительного происхождения// М.:Б.и..- 1977.- С.343 347

76. Никитенко В.И. Бактериальный препарат для профилактики и лечения вос-«. палительных процессов и аллергических заболеваний // Международная заявка. N 89/09607, WO, публ. 19.10.1989.

77. Никитенко В.И. Вместо лекарств бактерии // Наука в СССР. - 1991. - N 4. -С. 116-121.

78. Никитенко В.И. Штамм бактерий Bacillus subtilis, используемый для получения молочного продукта, предназначенного для лечения диатеза, дисбак-териоза и бактериальных инфекций // А.с. N 1648975, S.U. публ 15.05. 91.

79. Никитенко В.И., Никитенко И.К. Штамм бактерий Bacillus pulvifaciens, используемый для изготовления лечебно-профилактического препарата против бактериальных инфекций у животных // А.с. N 1723117, S.U. публ. 12. 1992.

80. Никитенко В.И., Никитенко И.К. Штамм бактерий Bacillus subtilis, используемый для получения препарата для профилактики и лечения противовоспалительных процессов и аллергических заболеваний // А.с. N 1723116, S.U. опубл. 12. 1992.

81. Никитенко Л.И., Никитенко В.И. Штамм бактерий Bacillus sp. компонент лечебно-профилактического препарата против дисбактериозов и аллергии // А.с. N 1710575, S.U. - публ. 5. 1992.

82. Никитенко В.И., Горбунова Н.Н., Жигайлов А.В. Споробактерин новый препарат для лечения дисбактериозов и гнойно-воспалительных процессов // Дисбактериозы и эубиотики: Тезисы докладов Всерос. научно-практ. конф. -М.- 1996.-С. 26.

83. Николичева Т.А., Тараканов Б.В., Голинкевич Е.К., Комкова Е.Е. Изменение биоценоза пищеварительного тракта поросят при включении в рацион Bacillus micilaginosis // Бюл. ВНИИ физиол., биохимии и питания с-х животных. 1989.-N 2. - С. 31-35.

84. Обухова О.В., Соболева Н.Н. О наличии фактора распространения в культурах сапрофитных споровых бактерий // Журн. микробиол. 1950. - N 12. С. 482-485.

85. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические рекомендации МУК 4.2.1980-04, 2004.

86. Осадчая А.И., Кудрявцев В.А., Сафронова JI.A. Влияние кислотности среды и температуры на рост и экскрецию полисахаридов Bacillus subtilis при глубинном культивировании // Мисробюл. журн. 1998. - Т. 60., N 4. - С. 25-32.

87. Осипова И.Г. Некоторые аспекты механизма защитного действия колибак-терина и споровых эубиотиков и новые методы их контроля.// Автореф. дис.канд.биол.наук.- М., 1997.- 25 с.

88. Осипова И.Г., Сорокулова И.Б., Терешкина Н.В., Григорьева JI.B. Изучение безопасности бактерий рода Bacillus, составляющих основу некоторых про-биотиков // Журн. микробиол. 1998. - N 6. - С. 68-70.

89. Осипова И.Г., Михайлова Н.А., Сорокулова И.Г., Васильева Е.А., Гайде-ров А.А. Споровые пробиотики. Журн. микробиол. - 2003. №3. с. 113-119.

90. Остерман Л.Д. Методы Исследования белков и нуклеиновых кислот. 1981.

91. Панин А.Н., Серых Н.И., Малик Е.В. и др. Повышение эффективности пробиотикотерапии у поросят/ Ветеринария, 1996. - N 3. - С. 17.

92. Панчишина М.В., Олейник С.Ф. Дисбактериоз кишечника. Киев, 1983

93. Паршина С.Н., Имшенецкий А.А., Нестерова Н.Г. и др. Штамм бактерий Bacillus сегеш"-продуцент протеолитических ферментов с тромболитическим действием // А. с. N 1615177, С 12N 1/20. Опубл. 23.12.90. - Бюл. N 4. 1988.

94. Перт С. Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М. Мир, 1978, 332 с

95. Петров Л.Н., Вербицкая Н.Б., Вахитов Т.Я. Конструирование препаратов для лечения и профилактики дисбактериоза на основе представлений о эндо-экологии человека // Рус. ж. Вич/Спид и родст. пробл. 1997.- Т. 1, N 1. С. 161-162.

96. Петровская В.Г., Марко О.П. Микрофлора человека в норме и патологии. М.:Медицина. -1976. -217 С.

97. Поберий И.А., Харечко А.Т., Садовой Н.В., Литусов Н.В. Новый комплексный эубиотик «биоспорин» для детей и взрослых / Здравоохранение Башкортостана. 1998. -N 1. - С. 97-99.

98. Погосян Г.П., Надирова А.Б., Калиев А.Б., Карабаев М.К. Плазмида pCLl и антимикробная активность штамма Bacillus sp. 62 II Молекулярная генетика, микробиол. и вирусология. 1999. - N 1. - С. 37-38.

99. Подберезный В.В., Париков В.А. Среда для культивирования бактерии-симбионта Bacillus pulvifaciens или Bacillus subtilis - продуцента пробиоти-ка// RU Патент № 2100029, опубл. 27.12.97. Бюл.№36.

100. Подберезный В.В., Полянцев Н.И., Ропаева Л.В. Культивирование производственных штаммов Bacillus subtilis в подсырной сыворотке // Ветеринария.- 1996.-N 1.-С. 21-29.

101. Подопригора Г.И. Иммунные и неспецифические механизмы колониза-ционнной резистентности.//Антибиотики и колонизационная резистентность/Груды ВНИИ антибиотиков.- М. -1990. -вып.Х1Х. -С. 15-25.

102. Полховский В.А., Буланов П.А. О декарбоксилазах аминокислот у Bacillus cereus //Микробиология. 1968. - Т. 37, N 4. - С. 600-604.

103. Поспелова В. В., Грачева Н.М., Антонова Л. В. и др. Биологические микробные препараты, их лекарственные формы и сферы применения //Новые лекарственные препараты: Экспресс информация. -1990. -Вып. 5. - С. 1-8.

104. Поспелова В.В., Рахимова Н.Г., Халенева М.П. и др. Новые сферы применения микробных биопрепаратов для коррекции бактериоценоза организма человека.//Иммунобиол. препараты. М. -1989. -С. 142-152.

105. Резник С.Р. Способ лечения и профилактики вирусных и бактериальных заболеваний животных // SU, А.с. N 1311243, опубл. 1982.

106. Резник С.Р., Сорокулова И.Б., Вьюницкая В.А. и др. Профилактический биопрепарат споролакт // Патент N 2035186. RU. - А 61 К 35/66, публ. 20.05.95, бюл. N 14.

107. Резник С.Р., Шуст И.И. Гематологические и цитохимические показатели телят при даче препарата Бактерии- SL // Биохимия сельскохозяйственных животных и продовольственная программа: Тез. докл. Всесоюзн. симпоз. -Киев, 1989. С. 25.

108. Решедько Г.К., Стецюк О.У. Особенности определения чувствительности микроорганизмов диско-диффузным методом. Современные методы клинической микробиологии, выпуск 1. Смоленск, 2003.

109. Ряпис JI.A., Липницкий А.В. Микробиологические и популяционно-генетические аспекты патогенности бактерий // Журн. микробиол. 1998. - N 6. С. 109-112.

110. Савицкая К.И. Нарушения микроэкологии желудочно-кишечного тракта и хронические болезни кишечника // Terra medica. - 1998. N 2. - С. 13-15.

111. Свечникова Е.Б., Максютова Л.Ф., Хунафин С.Н. и др., Опыт использования бактиспорина в комплексном лечении детей с термической травмой // Тез. докл: Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней. Санкт-П. - 1999 г. - С. 268.

112. Синев М.А., Бударина Ж.И., Гавриленко И.В. и др., Доказательство существования гемолизина II Bacillus cereus: клонирование генетической детерминанты гемолизина II // Молек. биол. 1993. - Т. 27, N 6. - С. 1218-1229.

113. Слабоспицкая А.Т., Крымовская С.С., Резник С.Р. Ферментативная активность бацилл, перспективных для включения в состав биопрепаратов // Микробиол. ж. 1990. - N2. - С. 9-14.

114. Смирнов В.В.,Резник С.Р., Василевская И.А. Спорообразующие аэробные бактерии продуценты биологически активных веществ. - Киев, 1982 - 280 с.

116. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская И.А. Спорообразующие аэробные бактерии - продуценты биологически активных веществ// Киев. Нау-кова думка.- 1983.- 278 с.

117. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. и др. О некоторых механизмах возникновения бессимптомной бактеремии // Микробиол. журн. 1988 -Т. 50,N6.-С. 56-59.

118. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. и др. Способ лечения гнойно-септических послеродовых заболеваний суспензией живых культур // А. с. N 1398868 S.U. - А 61 К 35/74. - публ. 30.05.88, бюл. N 20.

119. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. и др. Препарат биоспорин для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека // А. с. N 1722502. S.U. - А 61 К. 39/02, публ. 30.03.92.

120. Смирнов В.В.,Резник С.Р., Сорокулова И.Б., Вьюницкая В.А Дискуссионные вопросы создания и применения бактериальных препаратов для коррекции микрофлоры теплокровных // Микробиол. журн. 1992. - Т.54, N 6.- С. 82-92.

121. Смирнов В.В., Резник С.Р., Вьюницкая В.А., и др. Современные представления о механизмах лечебно-профилактического действия пробиотиков из бактерий рода BacillusII Микробиол. журн.- 1993.- 55,- № 4.С.92-112

122. Смирнов В.В., Осадчая А.И., Кудрявцев В.А., Сафронова JI.A. Рост и спорообразование Bacillus subtilis в различных условиях аэрации // Микробиол. журн. 1993. - Т. 55, N 3. - С. 38-44.

123. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. и др. Профилактический биопрепарат субалин // Патент N 2035185, RU. А 61 К 35/66, публ. 20.05.95, бюл. N 14.

124. Смирнов В.В., Сорокулова И.Б., Осипова И.Г. Биопрепарат субтикол для профилактики и лечения инфекционных болезней // Патент N 2129432. -А. 61 К 35/74. - Бюл. N 12, опубл. 27.04.99.

125. Смирнов В.В., Рева О.Н., Вьюницкая В.А. Создание и практическое применение математической модели антагонистического действия бацилл при конструировании пробиотиков // Мшробюлопчний журн. 1995. -Т. 64, N 5. -С. 661-667.

126. Смирнов В.В., Косюк И.В. Адгезивные свойства бактерий рода Bacillus-компонентов дробиотика // Мшробюлопчний журн. 1997. - Т. 69, N 6. - С. 36-43.

127. Сорокулова И.Б. Перспективы применения бактерий рода Bacillus для конструирования новых биопрепаратов // Антибиотики и химиотерапия. -1996. Т.41, N 10. - С. 13-15.

128. Сорокулова И.Б. Сравнительное изучение биологических свойств био-спорина и других коммерческих препаратов на основе бацилл // Мшробю-лопчний журнал. 1997. - Т. 69, N 6. - С. 43-49.

129. Сорокулова И.Б. Влияние пробиотиков из бацилл на функциональную активность макрофагов / Антибиотики и химиотерапия. 1998. - Т. 43, N 2. - С. 20-23.

130. Сторожук П.Г., Быков И.М., Сторожук А.П. Патогенетическая направленность белкового питания и заместительной ферментотерапии при имму-нодефицитных состояниях организма // International journal on immunorehabilitation. 1998. - N 10., С. 110-115.

131. Таболин В.А., Бельмер С.В., Гасилина Т.В. и др. Рациональная терапия дисбактериоза кишечника у детей. Методические рекомендации. М., 1998. -11с.

132. Топчий М.П. Применение препаратов из живых культур сенной палочки при дисбактериозах у телят: Автореф. дис. канд. биол. наук. Минск, 1997. -21 с.

133. Тришина Н.В. Связь между развитием дисбактериоза кишечника и состоянием антиэндотоксинового иммунитета. Автореф. дис. канд. мед. наук. -Москва, 2003., 24 с.

134. Учитель И.Я. Макрофаги в иммунитете. М 1978; 175.).

135. Фазылова А.А. Клинико-иммунологическое обоснование применения споробактерина и бактиспорина при дисбиозе кишечника у детей раннего возраста // Авт. кан. дис. Уфа. - 1998. - 24 с.

136. Харвуд К. Бациллы. Генетика и биотехнология. М., 1992. - С. 52.

137. Харченко С.Н., Резник С.Р., Литвин В.П. Способ борьбы с плесневением кормов // А.с. N 751382, СССР., опубл. в Б.И., 1980, N 28.

138. Хмель И.А., Чернин Л.С., Леванова Н.Б. и др. Штамм бактерий Bacillus pumilus для получения препарата против фитопатогенных микроорганизмов // Патенты 1817875 Россия F01N 63/00, C12N 1/20. опубл. 20.05.95. - Бюл. N 14.

139. Чернякова В.И., Береза Н.М., Селезнева С.И. Бактериологическая и иммунологическая эффективность препарата биоспорина при неспецифическом язвенном колите // Микробиол.ж. 1993. - Т. 55, N 3. - С. 63-67.

140. Чхаидзе И.Г., В.Г. Лиходед, и др. Корректирующее действие антител при экспериментальном дисбактериозе // Журн. Микробиол. 1998, №4: 12-14.

141. Шарп Р., Скавен М., Аткинсон Т. Бациллы: Генетика и биотехнология. -М. 1992. - 398 с.

142. Шевелева С.А. Пробиотики, пребиотики и пробиотические продукты. Современное состояние вопроса//Вопр.питан. -1999. -Т.68. -№2. -С.32

143. Шендеров Б. А. Медицинская микробная экология и функциональное питание.-М., 1998, Т. I, С. 287.

144. Шендеров Б.А. Колонизационная резистентность и химиотерапевтиче-ские и антибактериальные препараты.// Антибиотики и колонизационная резистентность: Труды ВНИИ антибиотиков. М. -1990. -вып.Х1Х. -С.5-16.

145. Шендеров Б.А., Манвелова М.А., Степанчук Ю.Б., Скиба Н.Э. Пробиотики и функциональное питание // Антибиотики и химиотерапия. 1997. - Т. 42, N 7. - С.30-34.

146. Шендеров Б.А.Медицинская микробная экология и функциональное питание.-М., 1998, Т. II, С. 413

147. Ямпольская Т.А., Великжанина Г.А., Жданова Н.И. и др. Штамм бактерий Bacillus subtilis продуцент L-фенилаланина: А.с. N 1693056, С 12 Р 13/22, опубл. 23.11.91. Бюл. N 43.

148. Adami A., Sandrucci A., Cavazzoni V. Piglets fed froom birthwith the probi-otic Bacillus coagulans as additive: Zootechnical and microbiological aspects // Ann. microbiol. ed enzimol. 1997. - V. 47, N 1. - P. 139-149.

149. Azuma I., Sugimura C., Iton S. Adjuvant activity of bacterial glycolipids // Jap. J. Microbiol. 1977. - V. 20, N 5. - P. 465-468.

150. Benedettini J. et al. Immunomodulation by Bacillus subtilis spores // Boll. 1st, SieroteMilan. 1983.-V. 62.,N6.-P. 509-516.

151. Berkel H., Hadlok R. Lecithinase-und Toxinbildung durch Stamme der Gat-tung Bacillus // Lebensmittelhygiene. 1976. - V. 27, N 2. - p. 63-65.

152. Bernheimer A., Avigad L. Nature and Properties of Cytolytic Agent produced by Bacillus subtilis // J. Gen. Microb.- 1970. V. 61, N 2. - P. 361-369.

153. Blaznic J, Kumel I.M., Salamum B. et al. Sdravljenje kronicne granulomotozne bolezni z acidofilnem mlecom // Zdrav.Vesth. 1976. N 45. - P. 77-79.

154. Boer A.S., Priest F., Diderichsen B. On the industrial use of Bacillus licheni-formis: A review // Appl. Microbiol, and Biotechnol. 1994. - V. 40, N 5. - P. 595-598.

155. Buchell M.E., Smith J., Lynch H.C. A phisiological model for the control of erytromycin production in batch and cyclyc fed batch cuiture // Microbiology. -1997. V. 143, N 2. - P. 475-480.

156. Cipradi G. et al. Effects of an adjunative treatment with Bacillus subtilis for foodallergy // Chemioterapia. -1986. 5, N6. -P.408-410

157. Cromwick A.M., Birrer G.A., Gross R.A. Effects of pH and aeration on y-poly (glutamic acid) formation by bacillus licheniformis in controlled batch fermentor cultures // Biotechnol. and Bioeng. 1996. - V. 50, N 2. - P. 222-227.

158. Danchin A., Glasser P., Kunst F. et al. Bacillus subtilis devoile ses genes // Biofutur. 1998. - N 174. - P. 14-17.

159. Devin K.M. The Bacillus subtilis genome project: Aims and progress // Trends Biotechnol. 1995. - V. 13, N 6. - P. 210-216.

160. Donovan W.P., Rupar M.J., Slanei A.C. Bacillus thuringiensis crytic, protein toxic to coleopteran isects // Патент N 5378625 США A61K 31/00. Опубл. 03.01.95.

161. Dubos R. Toxic factors in enzymes used in laundry products // Science. 1971. - N 3993. - P. 259-260.

162. Edlund C., Nord C.E. Effect of qinolones on intestinal ecology. Drugs, 1998, 58(2): 65-70.

163. Flindt M. Pulmonare disesase due to ingalation of derivates of Bacillus subtilis containing proteolytic enzyme // Lancet.- 1969. V. 1, N 7607. - P. 1177-1181.

164. Fox M. The phylogeny of procaryotes// Science. -1980. V. 209, N 4455. P. 457-463.

165. Fuller R. J Appl Bacteriol 1989; 66: 5: 365-378.

166. Gastro G.R., Ferrero M.A., Abate C.M. et al. Simultaneous production of alpha and beta amylases by Bacillus subtilis Mir-5 in batch and continuous culture // Biotechnol. Lett. 1992. - V. 14, N 1. - P. 49-54.

167. Glatz B.A., Spira W.M., Goepfert J.M. Alteration of vascular permeability in rabbits by culture filtrates of Bacillus cereus and related species // Infect, and Immunol. 1974. V. 10, N 2. - P. 299-303.

168. Guida V., Guida R. Importansia dos Bacillos esporulados aerobios em gastroenterologia e nutricao // Rev. Brasil. med. 1978. - V. 35, N 12. - P. 702707.

169. Haenel H., Bending J. Intestinal flora in health and disease // Progr. Food and Nutr. sci.- 1975.-V. 21, N l.-P. 64.

170. Himanen J.-P., Pyhala L., Olander R.-M. et al. Biological activites of lipo-teichoic acid and peptidoglycan teichoic acid of Bacillus subtilis 168 // J. Gen. Microbiol. - 1993.-V. 139,N 11.-P. 2659-2665.

171. Hirano Y., Matsudo M., Kameyama T. Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis of proteins synthesized during early germination of Bacillus subtilis 168 in the presence of actinomycin D // J. Basic Microbiol. 1991. - V. 31, N 6.- P. 429-436.

172. Humbert Florence Les probiotigues: un sujet d" actualite //Bull. inf. Stat. exp. auicult. Ploufragan. 1988. - V. 28, N 3. - P. 128-130.

173. Inouye S., Kondo S. Amicoumacin and SF-2370, pharmacologically active agents of microbiol origin // Novel Microbial Prod. Med. and Agr. Amsterdam. -1989.-P. 179-193.

174. Johnson С. E. Lethal toxin of Bacillus cereus 1. Relationships and nature of toxin, hemolysin and phospholipase // J. Bacterid. 1967. V. 94, N 2. - P. 306316.

175. Kakinuma A., Hori M., Isono M. Determination of fatty acid in surfactin and elucidation of the total structure of surfactin // Agric. and Biol. Chem. 1969. - V. 33. - P. 973-976.

176. Kaneko J., Matsushima H. Crystal-like structure in the sporulation cells of Bacillus subtilis 168 // J. Electron. Microsc.- 1973. V. 22, N 2. - P. 217-219.

177. Kaneko J., Matsushima H. Crystalline inclusions in sporulating Bacillus subtilis cells // In: Spores YI. Select. Pap. 6th Int. Spore Conf. Washington. - 1975. -P. 580-585.

178. Kitazawa H., Nomura M., Itoh T. J Dairy Sci 1991; 74: 7: 2082 2088.

179. Kubo Kazuhiro. Pure culture of Bacillus subtilis FERM BP-3418 // Пат. N 5364738. США. МКИ A01N 25//00. - публ. 15.11.94.

180. Kudrya V.A., Simonenko L.A. Alkaline serine proteinase and lectine isolation from the culture fluid of Bacillus subtilis // Appl. Microbiol, and Biotechnol. -1994.-V. 41,N5.-P. 505-509.

181. Le H., Anagnostopoulos C. Detection and characterization of naturally occur-ing plasmids //Molec. Gen. Genet. 1977. - V. 157. - P. 167-174.

182. Legakis N.J., Papavassilion J. Thin-layer chromatographic technique for rapid detection of bacterial phospholipases // J. Clin. Microbiol.- 1975. V.2, N 5. - P. 373-376.

183. Leviveld H.L.M., Bachmayer H., Boon B. et al. Safe biotechnology. Part 6. Safety assessment, in respect of human health of microorganisms used in biotechnology // Appl. Microbiol, and Biotechnol. 1995. V. 43, N 3. - P. 389-393.

184. Lin S.-C., Carswell K.S., Sharma M.M., Georgiou G. Continuos production of the lipopeptide biosurfactant of Bacillus licheniformis JF-2 // Appl. Microbiol, and Biotechnol. 1994. - V. 41, N 3. - P. 281-285.

185. Lovett P., Bramucci M. Plasmid DNA in bacilli // In: Microbiology- Washington. 1976. - P. 388-393.

186. Markham R., Wilkie B. Influence of detergent on aerosol allergic sensitization with enzymes of Вас. subtilis // Int. Arch. Allergy and Appl. Immunol. 1976. -V. 51, N 5. - P. 529-543.

187. Maruta Kiyoshi Exclusion of intestinal pahogens by continuous feeding with Bacillus subtilis C-3102 and its influence on the in testinal microflora in broilers // Anim. Sci. and Technol. 1996. - V. 67, N 3. - P. 273-280.

188. Moszer I., Glaser P., Danchin A. SubtiList: A relational database for the Bacillus subtilis genome // Microbiology. 1995. - V. 141, N 2. - P. 261-268.

189. Murray P.R., Baron E.J., Pfaller M.A., Tenover F.C., Jolken R.H., Manual of Clinical Microbiology, 7th Edition, Washington D.C., ASM Press, 1999

190. Nozari-Renard J. Induction d 5, OInterferon par Bacillus subtilis // Ann. Microbiol. 1978. - V. 129a. - N 4. - P. 525-542.

191. Oh M.K., Kim B.G., Park S.H. Importance of spore mutants for fed-batch and continuous fermentation of Bacillus subtilis // Biotechnol. and Bioeng. 1995. -V. 47, N 6. - P. 696-702.

192. Payne Jewel M. Isolates of Bacillus thuringiensis Hist are active ayanist nematodes / Патент N 5151363, C12 N 1/20, A 01 N 63/00, заявл. 27.07.90., опубл. 29.09.92.

193. Pepys J., Hargreave F., Longbotton Y. Allergic reactions of the lungs to enzymes of Bacillus subtilis // Lancet. 1969. - V. 1, N 44 - 7607. - P. 1181-1184.

194. Peterson W.L., Mackrowiak Ph.A., Barnett C.C. et al. The human gastric bactericidal barrier: Mechanisms of action, relative antibacterial activity, and dietary influences.//J. Infec. Diseases. -1989. -159 № 5. -p.978-985.

195. Prasad S.S.V., Shethna G.J. Biochemistry biological activities of the proteina-ceous crystal of Bacillus thuringiensis // J. Sci. and Ind. Res. 1976. - V. 35, N 10. - P. 626-632.

196. Rocchietta I. The use of Bacillus subtilis in the treatment of the diseases/Minerva Med. -1969. -60. N3/4. -P. 117-123.

197. Rosental G.J., Corsini E. // Methods Immunotoxicol. 1995. V 1, P 327-343

198. Rychen G., Simoes Nunes C. Effets des flores lactigues des produits laitiers fermentes: Une base scientifigue pour l"etude des probiotiques microbiens dans l"espece porcine // Prod. anim. 1995. - V. 8, N 2. - C. 97-104.

199. Salminen Seppo Clinical aspects of probiotics //Ecol. health and Disease.-1999.- 11.-N4.-P. 251-252

200. Shore N., Greene R., Kezeni H. Lung disfuction in worcers exposed to Bacillus subtilis // Environm. Res. 1971. - V. 4, N 6. - P. 512-519.

201. Slein M., Logan G., Characterization of the phospholipases of Вас. cereus and their effects on erytrocytes, bone and kidnei cells // J. Bacteriol. 1965. - V. 90, Nl.-P. 69-81.

202. Somerville H.J. The insecticidal endotoxin of Bacillus thuringiensis // In: Sem. etude theme Prod, natur. et prot. plant. 1977. - P. 253-268.

203. Spira W., Goepfert J. Biological characteristics of an enterotoxin produced by Bacillus cereus // Can. J. Microbiol. 1975. - V. 21, N 8. - P. 1236-1246.

204. Stgard Henri Microbielle v kstfremmer til svin. Teori og prasksis/ Dan veterinaertidsskr. 1989. - V. 72, N 15. - P. 855-864.

205. Su Li, Zhang Zhihong, Xiao Xianzhi, Wang Xiaomin Wuhan daxue xuebao. Ziran kexue ban // J. Wuhan Univ. Natur. Sci. Ed. 1996. - V. 42, N 4. - C. 516518.

206. Sumi H. Physiological function of natto // J. Brew. Soc. Jap. 1990. - V. 85, N 8.-P. 518-524.

207. Tihole F. Fizioloski pomer backteriemije z geiunalo microflora // Zdravstv vestn 1982. - V. 51, N 1. P. 3-5.

208. Towalski Z., Rothman H. Enzyme technology //in: The Biotechnological Challenge. Cambridge University Press. Cambridge, 1986 - P. 37 -76.

209. Tsuge Kenji, Ano Takashi, Shoda Macoto. Characterization of Bacillus subtilis YB8, coproducer of lipopeptides surfactin and plipastatin B1 //J. Gen. and Appl. Microbiol. 1995.- 41, N 6. P. 541-545.

210. Van der Waaij D. Colonization resistance of the digestive tract: mechanism and clinical consequences.//Nahrung. -1987. -31 № 5. -p.507-524.

211. Vollaard E.J., Clasener H.A.L., Janssen J.H.M. The contribution of Escherichia coli to microbial colonization resistance.//.!, of Antimicrobial Chemotherapy. -1990.- 26. -p.411-418